基于Parkin基因探讨补明牵正方对帕金森病细胞模型线粒体的保护作用

作     者：柴原 

作者单位：北京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙红梅

授予年度：2019年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：帕金森病 补阴牵正方 Parkin MPP+ 线粒体 

摘      要：研究背景帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是一种老年神经退行性疾病,其发病率仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）。PD以中脑黑质区多巴胺（Dopamine,DA）能神经元变性、缺失和路易小体形成为主要病理改变,出现静止性震颤、肌强直、运动迟缓等特征性运动障碍和非运动性症状如:睡眠障碍、自主神经障碍等。其发病原因目前并不十分清楚,普遍认为与遗传、环境和年龄老化等因素有关。在PD研究中发现,其发病机制与线粒体密切相关,而Parkin是最常见的PD遗传易感基因之一,其突变或缺失可导致线粒体形态和功能改变,引发PD样症状,目前已成为研究PD发病机制的热点之一。PD治疗多以对症治疗为主,临床多采用左旋多巴及多巴胺受体激动剂的联合的治疗方案,虽然能在一定程度上缓解其症状,但长时间使用会出现药效减退,开关现象等副作用。中医临床治疗因其独特的理论体系和辨证论治的思想,取得了较为稳定的疗效。补阴牵正方（Bu-Yin-Qian-Zheng Formula,BYQZF）是由临床常用方剂大补阴丸（Da-Bu-Yin-Wan,DBYW）和牵正散（Qian-Zheng-San,QZS）组成的合方。本课题组在前期的实验研究中已明确了中药复方DBYW合QZS可以调控PD小鼠脑部线粒体酶复合物的活性及其基因表达,减轻线粒体DNA的损伤,在体外实验中证实其对MPP+介导的PD模型细胞线粒体功能具有明确的保护作用。在此研究的基础上,本实验以Parkin基因为切入点,通过现代分子生物学技术与传统中医理论相结合从细胞、分子水平,进一步探究BYQZF对PD细胞模型线粒体保护的作用环节和机制。研究目的本研究从Parkin基因角度,以线粒体为中心,揭示BYQZF对PD细胞模型中线粒体的保护作用,阐明BYQZF对PD中线粒体形态和功能的保护与Parkin基因调控的相关性,揭示BYQZF与Parkin蛋白及线粒体分裂和融合蛋白之间的联系,深入探寻BYQZF维持PD细胞模型中线粒体动态平衡的作用环节和分子机制。为中医临床应用提供进一步的实验依据,为中药的新药研究和开发奠定基础。研究方法实验一 Parkin基因敲减细胞模型的构建:采用RNAi技术构建Parkin敲减质粒并瞬时转染SH-SY5Y细胞,实验分3组:①正常对照组,不进行转染;②阴性对照组,转染阴性质粒;③Parkin敲减组,转染Parkin敲减质粒。荧光显微镜观察SH-SY5Y细胞转染情况;流式细胞仪检测GFP表达率;RT-qPCR技术检测Parkin mRNA的表达;Western Blot技术检测Parkin蛋白的表达。实验二补阴牵正方对Parkin基因敲减PD细胞模型线粒体形态和功能的影响:实验分6组:①阴性质粒组,转染阴性质粒;②阴性质粒+MPP+组,转染阴性质粒后给予MPP+造模;③阴性质粒+MPP＋+中药组,转染阴性质粒后给予MPP+造模并进行中药干预;④Parkin敲减组,转染Parkin敲减质粒;⑤Parkin敲减＋MPP+组,转染Parkin敲减质粒后给予MPP+造模;⑥Parkin敲减＋MPP++中药组,转染Parkin敲减质粒后予MPP+造模并进行中药干预。CCK-8法检测各组细胞的存活率;MTR（MitoTracker（?）Red CMXRos,MTR）线粒体探针标记线粒体激光共聚焦扫描显微镜观察线粒体的形态,利用软件分析线粒体形态因子、网络平均分支长度和数量及线粒体活性;荧光素酶法检测细胞中ATP水平;线粒体探针TMRM检测线粒体膜电位。实验三补阴牵正方对Parkin基因敲减PD细胞模型线粒体动态平衡的影响:分组同实验二。Western Blot技术检测:控制线粒体质量的相关蛋白PINK1和Parkin的表达。免疫荧光双标技术及激光共聚焦扫描显微镜分别观察:①Parkin蛋白与PINK1蛋白在细胞的表达及共定位关系;②Parkin蛋白的亚细胞定位:与MTR线粒体探针共标记。Western Blot技术检测:①线粒体融合相关蛋白Mfn１、Mfn2及OPA1的表达;②线粒体分裂相关蛋白Fis１和Drp１的表达。研究结果实验一结果:1.转染情况的观察:阴性对照组及Parkin敲减组能够观察到较多的绿色荧光,绿色荧光蛋白表达率增加（转染质粒携带绿色荧光蛋白）。*** mRNA及蛋白表达的检测:Parkin敲减组细胞内的Parkin mRNA和蛋白的表达均显著降低,提示Parkin基因低表达细胞模型成功。实验二结果:1.细胞存活率的变化:转染阴性质粒的SH-SY5Y细胞用神经毒素MPP+处理后细胞存活率明显下降,中药BYQZF处理后其细胞存活率显著提高,而parkin敲减组细胞较阴性质粒组细胞存活率明显下降。parkin敲减细胞用MPP＋造模其