补阴牵正方调控钙稳态抑制PD小鼠DA神经元丢失的机制探讨

作     者：赵海虹 

作者单位：北京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙红梅

授予年度：2020年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：补阴牵正方 Ca2+ 多巴胺神经元 帕金森病 细胞凋亡 

摘      要：研究背景帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是世界上发病率第二高的神经退行性疾病,好发于中老年人,中国的患病人数约占世界患病人数的一半,且随着中国老龄化人口的增加,发病率呈逐年增加趋势。PD的典型病理改变为中脑黑质多巴胺（Dopamine,DA）神经元变性死亡,导致纹状体DA减少,出现运动迟缓、肌强直、静止性震颤等运动症状以及便秘、吞咽困难、睡眠障碍、抑郁等非运动症状。PD的发病原因复杂,近年来细胞凋亡与Ca2+关系的研究增多,普遍认为钙稳态失衡导致DA神经元凋亡进而引发PD是其主要机制之一。目前PD尚无根治方法,多使用多巴胺替代药物、单胺氧化酶抑制剂、儿茶酚氧位甲基转移酶抑制剂、抗胆碱能药等药物治疗,对于临床症状有一定的改善作用,但存在长期使用疗效降低、副作用明显等问题。在整体观思想指导下的传统中医学,凭借辨证论治的独特理论体系,利用诸多中药不同功效的发挥,在PD的治疗中起到重要作用,可明显改善患者的运动症状和非运动症状,且疗效持久稳定、不良反应少。研究证实,肝肾阴虚型PD在临床上所占的比例居各证型之首,其他证型多由此变化而成,滋补肝肾为主的方法治疗PD具有良好效果。补阴牵正方为大补阴丸和牵正散的合方,由治疗PD的常用药物知母、熟地、龟板、僵蚕、全蝎等组成,具有滋补肝肾以治本、息风通络以治标的功效。本课题组前期使用补阴牵正方治疗神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）介导的 PD 模型小鼠,在黑质DA神经元数目和形态方面表现出明显的保护作用。在此基础上,本实验从Ca2+角度,进一步探讨补阴牵正方对PD中DA神经元凋亡的作用机制与调控环节。研究目的本实验从补阴牵正方调节Ca2+稳态的角度,揭示中药复方在PD发病过程中对PD小鼠脑线粒体和内质网功能的保护作用与调控细胞质、线粒体和内质网Ca2+浓度的相关性,探寻补阴牵正方抑制线粒体和内质网途径细胞凋亡和保持Ca2+稳态的环节,进一步阐明补阴牵正方保护DA神经元的分子机制,为临床应用补阴牵正方治疗PD提供实验依据。研究方法实验一补阴牵正方对PD小鼠脑神经元凋亡的抑制作用。实验分3组,①正常组:不做任何处理;②模型组:腹腔注射MPTP;③中药组:除腹腔注射MPTP外,灌胃补阴牵正方水煎剂。爬杆实验和悬挂实验检测小鼠的行为学;免疫荧光法观察中脑黑质TH阳性神经元的变化;高效液相电化学技术检测前脑DA及其代谢产物含量;Tunel法检测中脑黑质神经元凋亡的变化。实验二补阴牵正方对PD小鼠脑内线粒体和内质网功能的影响。实验分组同前。荧光素酶法检测脑组织ATP含量;荧光染色法检测脑组织ROS含量;免疫荧光法观察中脑黑质Cytc阳性细胞的变化;Western Blot技术检测脑组织Cyt c、Caspase-3、GRP78蛋白的表达水平。实验三补阴牵正方对PD小鼠脑内Ca2+和相关通道蛋白的影响。实验分组同前。Ca2+特异性荧光探针分别检测脑组织细胞质游离Ca2+浓度、内质网Ca2+浓度、线粒体Ca2+浓度;Western Blot技术检测线粒体外膜上的VDAC1蛋白、线粒体内膜上的MCU蛋白的表达水平。研究结果实验一:1.在行为学方面:MPTP可造成C57BL/6J小鼠爬杆时间增加、悬挂得分减少。补阴牵正方可使MPTP处理过的小鼠爬杆时间减少、悬挂得分增加。2.在黑质神经元和DA含量方面:MPTP可造成C57BL/6J小鼠脑组织黑质TH阳性神经元数量减少,黑质神经元凋亡率增加,前脑DA及其代谢产物含量降低。补阴牵正方可改善MPTP造成的这些变化,与模型组相比,中药组小鼠黑质TH 阳性神经元数量增加,黑质神经元凋亡率减少,前脑DA含量增加,而前脑DA代谢产物含量无明显差异。实验二:1.在线粒体和内质网功能方面:MPTP可造成C57BL/6J小鼠脑组织ATP减少、ROS增加。补阴牵正方可使MPTP处理过的小鼠脑组织ATP增加、ROS减少;MPTP可增加C57BL/6J小鼠脑组织GRP78蛋白表达。补阴牵正方能够降低MPTP导致的GRP78蛋白过表达。2.在线粒体途径和内质网途径介导的细胞凋亡方面:MPTP可导致C57BL/6J小鼠脑组织Cyt c、Caspase-3蛋白表达增多,同时黑质Cyt c荧光增强。补阴牵正方能够减少MPTP造成的PD小鼠脑组织Cyt c、Caspase-3蛋白的过表达,减少黑质Cyt c的荧光强度。实验三:1.在脑内Ca2+度方面:MPTP可导致C57BL/6J小鼠脑组织内质网Ca2+减少、细胞质Ca2+增加、线粒体Ca2+增加。补阴牵正方能拮抗MPTP造成的这些变化,使小鼠脑组织内质网Ca2+增加、细胞质Ca2+减少、线粒体Ca2+减少。