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利用融合标签纯化和表达β-甘露聚糖酶

利用融合标签纯化和表达β-甘露聚糖酶

作者：苏冬妹黑龙江大学

学位级别：硕士

甘露聚糖酶(β-mannanase;endo-1,4-β-D-mannan mannohydrolase;EC3.***.1.78)是一种非常重要的半纤维素酶,尤其是在麻类生物脱胶领域。本研究以甘露聚糖酶产生菌地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniform)HDYM04的基因组DNA为模板,采用PCR扩增的方法扩增得到其甘露聚糖酶基因,将基因片段与融合表达载体pET28a连接后转化进入大肠杆菌BL21(DE3),进而对重组酶的酶学性质进行了研究。克隆所得甘露聚糖酶基因片段长度为1282bp。对所获得片段进行相应生物信息学分析,结果表明该酶与芽孢杆菌属的甘露聚糖酶同源性最高,为酸性甘露聚糖酶,分子量约为38kD,无信号肽和跨膜区,具有MANB和糖苷水解酶两个结构域。构建甘露聚糖酶的异源重组菌株后对重组菌株进行诱导表达,筛选出酶活性最高的HDEM8菌株进行诱导条件和酶学性质的研究,菌株HDEM8的初始酶活力为38.60U/mL。经以IPTG终浓度、诱导温度和时间为因子的正交试验优化后,确定最优诱导条件为IPTG终浓度1.0mmol/L、30℃、诱导培养7h。酶活最高达到45.57U/mL。将诱导后的HDEM8菌株细胞裂解物经His·Bind Columns纯化后进行酶学性质分析,结果表明:适合反应温度为50℃-60℃,最适温度为55℃;适合反应pH为pH4.5-pH6.0,pH酸性时稳定性,中性和偏碱性时稳定性差。该酶表现出较好的耐高温活性,但是pH稳定性区域较窄。利用融合标签表达和纯化甘露聚糖酶,为HDYM04及其所产甘露聚糖酶在生物脱胶和其他领域中的应用提供了理论依据,同时也为本实验室建立在大肠杆菌BL21(DE3)融合表达外源基因的平台。

关键词：甘露聚糖酶融合标签纯化表达

抗融合标签单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

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抗融合标签单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

作者：户义中国人民解放军第四军医大学

学位级别：硕士

融合蛋白(fusion protein)是将两个或两个以上的基因通过一定方式连接在一起共同表达出的重组蛋白。标签融合蛋白(tag fusion protein)是融合蛋白的一种，它是由目的蛋白(target protein)和融合标签(fusion tag)共同构成的蛋白嵌合体。... 详细信息

融合蛋白(fusion protein)是将两个或两个以上的基因通过一定方式连接在一起共同表达出的重组蛋白。标签融合蛋白(tag fusion protein)是融合蛋白的一种，它是由目的蛋白(target protein)和融合标签(fusion tag)共同构成的蛋白嵌合体。常见的融合标签包括：多聚组氨酸(poly-His)、FLAG多肽、葡萄球菌蛋白A(SPA)、免疫球蛋白的Fc段以及谷胱甘肽转移酶(GST)等。融合标签的使用不仅方便了目的蛋白的表达和纯化，同时为目的蛋白结构和功能的研究提供了便利手段。随着人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)的完成，后基因组学(post-genomics)和蛋白质组学(proteomics)已经成为生命科学发展的重点，这一时期，科学家面临的最大挑战是在整体水平上系统地、综合地研究蛋白质的结构、功能以及蛋白质与蛋白质、核酸等生物大分子之间的相互作用。蛋白质的表达和纯化是蛋白质研究的关键环节。与标签蛋白融合表达提供了一个高通量(high-through)表达和筛选功能蛋白的平台，因而为学者广泛重视，已成为一条联系基因组和蛋白质组的重要纽带。另外，融合蛋白在蛋白复合物的分离、药物筛选以及临床治疗等领域也发挥着重要作用。单克隆抗体技术是1975年由Khler和Milstein共同创立的用于生产针对单一表位抗体的免疫学技术。由于单克隆抗体具有纯度高、特异性强、效价高、少或无交叉反应等优点，被广泛应用于生命科学的各个领域。在蛋白质组学的研究中，针对融合标签的单克隆抗体不但可以作为亲和层析介质对融合蛋白进行分离和纯化，还可以方便地研究目的蛋白质的分布和功能，是后基因学研究的重要工具。一本实验中，我们制备了7株稳定分泌抗Ig融合蛋白FC段单克隆抗体的杂交瘤细胞株FMUI7CI～7，其中FMUFCZ、F刚FC4、FMUFCS和F删FC6 为 IgGI（K）;FMUFCI、F删FC3及 FMwC7为 IgGZb（K）。7株 InAb所未腹水效价为在 0．5～IXIO－’，酶标 a效价为在 10叫～10刁。竞争 ELISA u 生物传感器分析表明，获得的7株单克隆抗体识别7个不同的表位，其中 FMUFCS、FMUFC6和FMUFC3的表位比较接近，FMUF。2和FMU’FC4的表位相差最远。在表位分析的基础上，我们利用FMUFC4作为包被抗体， H肚F 作为酶标记抗体，构建了用于检测Ig融合蛋白的双单抗夹心 ELISA系统，并通过选择包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度对其进行了优化。敏感性与特异性试验表明该系统的检测水平达到Zv叭且与其它物种的IgG没有交叉反应。利用该系统对COS河细胞表达的LAIRl工g融合蛋白和抗Notch配体Deftal的嵌合抗体进行了测定，均获得浓度依赖的A 值曲线。这表明，该夹心ELISA系统能够用于细胞培养上清中的Ig融合蛋白和嵌合抗体水平的检测。有趣的是尽管 F则FC3、FMUFCS和 F刚FC6 的表位非常接近，但在免疫印迹只有FMUFC6可同时用于Ig融合蛋白和 hlgG的免疫印迹检测，提示在蛋白质变性过程中，随着蛋白质空间结构的破坏，许多抗体识别的表位会消失或减弱，进一步说明抗原抗体之间的特异性反应有赖于抗原和抗体分子在空间结构上的识别，而不仅仅取决于氨基酸在蛋白质中的线性排列。利用 FMUFCS InAb制备的亲和层析柱，对转染后COS河细胞培养上清的LAIR1 融合蛋白进行纯化，纯化产物经 ***后显示层析所得蛋白质的分子量与理论值相符，纯度大于 80％。这说明免疫亲和层析能够有效的纯化培养基中的Ig融合蛋白，为Ig融合蛋白纯化提供了新的有效途径。另外，我们对我室制备的5株抗GST、5株抗m 和 1株抗FLAG单克隆抗体进行了比较系统的鉴定，并对其中部分单克隆抗体进行了初步应用研究。结果表明除抗FLAG单克隆抗体的腹水效价较低，不能用于相应融合蛋白的免疫印迹外，其他 10株单克隆抗体的腹水效价均在 10’～10’之间，并且全部可以用于相应融合蛋白的免疫印迹检测。比较发现，抗His标签的单克隆抗体制备的亲和层析柱对m 融合蛋白的纯化效果优于以 N iu十TA 为基质的金属亲和层析。 FasL是重要的凋亡诱导配体（poptosis inducing ligand，AIL），在免疫防御和免疫自稳中发挥着重要作用。FasL抗原以及抗 FasL ti体在基础和临床研究中有巨大的应用价值。我们采用基因工程技术，构建并表达了人FasL 胞膜外区与GST的融合蛋白并利用抗GST和抗hFasL的单克隆抗

关键词：标签融合蛋白融合标签 Ig融合蛋白单克隆抗体免疫印记 ELISA 亲和层析凋亡诱导配体

硫磺菌蘑菇凝集素作为融合标签在蛋白质表达和纯化中的应用研究

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硫磺菌蘑菇凝集素作为融合标签在蛋白质表达和纯化中的应用研究

作者：李晓静河南农业大学

学位级别：硕士

基因工程技术、基因组学和蛋白质组学技术的发展使得重组蛋白表达技术日益成熟。重组蛋白已经在生物、医药、农业和畜牧兽医等多种领域得到广泛应用。但是,重组蛋白的快速和廉价纯化依然是蛋白质规模化制备的瓶颈。亲和标签是蛋白质纯... 详细信息

基因工程技术、基因组学和蛋白质组学技术的发展使得重组蛋白表达技术日益成熟。重组蛋白已经在生物、医药、农业和畜牧兽医等多种领域得到广泛应用。但是,重组蛋白的快速和廉价纯化依然是蛋白质规模化制备的瓶颈。亲和标签是蛋白质纯化的高效工具,能够从污染的宿主蛋白中一步纯化重组的目的蛋白。目前,已经有多种亲和标签被用于蛋白质的表达和纯化。最常用的亲和标签包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S转移酶(GST)标签、葡萄球菌蛋白A(SPA)、硫氧还蛋白(TRX)、小泛素样修饰蛋白(SUMO)和六聚组氨酸标签(6×His)等。使用这些标签需要将标签对应的配体偶联到固相载体上,利用标签与配体的可逆性结合特性,利用合适的洗脱条件将目的蛋白洗脱和纯化。考虑到与将配体偶联到固相载体相关的蛋白纯化费用,商品化纯化介质均十分昂贵且只能重复利用数次等问题,现有的纯化标签系统无一适合蛋白质的规模化制备。本论文利用硫磺菌蘑菇凝集素(LSL)可逆性结合琼脂糖的特性,将其作为融合标签,建立了一种一步纯化LSL标签融合蛋白的方法。不用任何处理的琼脂糖凝胶柱和乳糖溶液分别作为LSL标签蛋白的特异性吸附剂和洗脱剂。所构建的表达载体中在LSL标签的下游含有烟草花叶病毒(TEV)蛋白酶识别位点,方便后续融合蛋白分子中LSL标签的去除。为了纯化不含标签的目的蛋白,本论文表达了带有LSL标签的TEV蛋白酶。本研究构建的LSL融合标签表达与纯化系统具有表达蛋白可溶性好、纯化工艺简单、成本低等优点,为实现规模化生产和纯化性状确切的蛋白提供新的思路。研究内容包括以下三个方面:1.硫磺菌蘑菇凝集素融合标签表达载体构建本研究通过合成硫磺菌蘑菇凝集素(LSL)N端含187个氨基酸的糖结合域,并在其下游引入烟草花叶病毒蛋白酶(TEV)的识别位点,通过克隆获得重组质粒p ET-LSL,随后将重组质粒转化至*** BL21(DE3)宿主菌中,经IPTG诱导进行表达。所构建的p ET-LSL重组质粒能够在BL21(DE3)中表达可溶性的硫磺菌蘑菇凝集素,而且所表达的凝集素可以经琼脂糖凝胶柱Sepharose-4B一步纯化,可以得到单纯的凝集素。为构建以硫磺菌蘑菇凝集素为标签的廉价、高效重组蛋白表达和纯化方法奠定基础。2.模式蛋白表达与纯化本研究在硫磺菌蘑菇凝集素融合标签表达载体构建成功后,以该重组质粒为基础,分别以绿色荧光蛋白GFP和PCV2的衣壳蛋白(Cap)为模式蛋白,进一步研究硫磺菌蘑菇凝集素作为融合标签在蛋白表达上的应用。通过克隆的方法,成功构建了重组质粒p ET-LSL-GFP和p ET-LSL-Cap。分别将重组质粒转化至BL21(DE3)宿主菌中,经IPTG诱导进行表达。实验表明GFP和Cap重组蛋白都能以可溶性形式进行表达,可溶性表达水平在90%左右,经琼脂糖凝胶柱Sepharose-4B一步纯化,可以得到单纯的重组蛋白。在荧光下观察重组蛋白LSL-GFP,可以看到明显的荧光,通过Western Blot,重组蛋白LSL-Cap可被PCV2多克隆抗体特异性识别,证明LSL融合标签不影响模式蛋白的生物学活性和抗原性。3.用于切割融合蛋白的TEV工具酶表达与纯化本研究利用硫磺菌蘑菇凝集素作为标签,构建了表达TEV蛋白酶的重组质粒p ET-LSL-TEV,将重组质粒转化至BL21(DE3)宿主菌后,经IPTG诱导表达。实验表明TEV重组蛋白酶以可溶性形式表达,可溶性水平为60%左右,经琼脂糖凝胶柱Sepharose-4B一步纯化后,可以得到单纯的重组蛋白。所表达的TEV蛋白酶具有良好生物学活性,可以将目的蛋白与LSL标签一步分离。总之,本论文研究结果证明硫磺菌蘑菇凝集素LSL可以作为有效的亲和标签,并且具有以下优势:(1)LSL标签可以一步亲和层析纯化融合蛋白;(2)LSL标签可以提高目的蛋白的可溶性,并且对靶蛋白的功能不产生影响。值得指出的是,Sepharose-4B柱经过含0.2 M乳糖的PBS洗净残留蛋白后,再用PBS洗涤,可以多次重复使用。此外,因为琼脂糖本身就是树脂,并且可以作为LSL标签的配体,本研究所使用的方法比传统需要配体固定到树脂上的亲和纯化方法更廉价、方便。

关键词：硫磺菌蘑菇凝集素融合标签烟草花叶病毒蛋白酶琼脂糖凝胶模式蛋白表达与纯化

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融合标签技术在膜蛋白结构研究中的应用

生物技术通讯 2009年第1期20卷 138-142页

作者：谢浩郭小明武汉理工大学理学院生物科学与技术系湖北武汉430070

膜蛋白高级结构的研究包括不同的层次,即膜蛋白拓扑学结构的研究、利用核磁共振技术和蛋白质晶体衍射技术对三维结构的研究,以及膜蛋白复合体的研究。在研究过程中,如果能够基于膜蛋白的拓扑学结构预测,选择合适的蛋白质或多肽融合标签... 详细信息

膜蛋白高级结构的研究包括不同的层次,即膜蛋白拓扑学结构的研究、利用核磁共振技术和蛋白质晶体衍射技术对三维结构的研究,以及膜蛋白复合体的研究。在研究过程中,如果能够基于膜蛋白的拓扑学结构预测,选择合适的蛋白质或多肽融合标签,利用基因融合技术在基因水平上对膜蛋白进行改造,可以产生含有融合标签的重组膜蛋白,不仅具有原有膜蛋白的功能活性,还具有融合标签所特有的生理生化特性,将会极大地促进膜蛋白结构和功能的研究。我们就目前膜蛋白结构研究中所涉及的融合标签技术及其应用策略和所取得的进展做一简述。

关键词：膜蛋白融合标签拓扑学结构膜蛋白三维结构膜蛋白复合体

一种可提高大肠杆菌中外源蛋白表达水平的新型融合多肽标签

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一种可提高大肠杆菌中外源蛋白表达水平的新型融合多肽标签

作者：魏敏厦门大学

学位级别：硕士

利用基因工程重组技术制备重组蛋白是蛋白质结构与功能研究的基础。以大肠杆菌(Escherichia coli,***为表达宿主的原核蛋白表达系统,具有操作简便、成本低廉、易扩大培养等优点,在生物医学研究中广泛应用。但该系统也存在一些不足,主要... 详细信息

利用基因工程重组技术制备重组蛋白是蛋白质结构与功能研究的基础。以大肠杆菌(Escherichia coli,***为表达宿主的原核蛋白表达系统,具有操作简便、成本低廉、易扩大培养等优点,在生物医学研究中广泛应用。但该系统也存在一些不足,主要包括部分重组蛋白的可溶性表达水平低、可能因折叠不正确而呈包涵体表达、蛋白不稳定易降解等,导致目的蛋白制备纯化的难度增加。蛋白融合标签的发明和应用可部分解决大肠杆菌中重组蛋白表达的相关问题,如采用GST(谷胱甘肽-S转移酶)、MBP(麦芽糖结合蛋白)、TrxA(大肠杆菌硫氧还蛋白)等标签与目的蛋白进行融合表达,可提高靶蛋白在大肠杆菌中的可溶性,促进靶蛋白正确折叠,提高稳定性进而提高表达量。但是,目前已知能提高重组蛋白表达量的融合标签,大多是分子量较大的融合蛋白,容易影响到靶蛋白的构象和功能。已报道的小分子多肽标签,如His(多聚组氨酸标签)、Flag(DYKDDDDK八肽)等,一般仅有助于目的蛋白亲和层析纯化或是检测鉴定,并不具备改善目的蛋白表达水平的功能。因此,发展能提高大肠杆菌中外源蛋白表达水平的融合短肽标签对于优化和改进基于***的重组蛋白基因工程技术体系有重要意义。我们在前期研究中发现,超折叠绿色荧光蛋白(superfolder GFP,sfGFP)的第11个β折叠的最末端16个氨基酸的肽段变体RDHMVLHEYVNAAGIT(S11),不仅能与sfGFP1-10结合产生绿色荧光,并且能显著增强重组蛋白的表达量。本研究构建了融合S11标签的重组蛋白表达质粒,通过SDS-PAGE和Dot-blotting对比评估多个不同重组蛋白的表达量及可溶性表达情况,并且对纯化的重组蛋白结构和功能进行分析,结果表明S11标签具备成为一种可提高重组蛋白表达水平的融合标签的潜力。此外,本研究通过设计S11标签N端或C端序列截短,揭示了该标签中能提高重组蛋白表达水平的关键氨基酸序列。本研究的主要结果详述如下:(1)以HBV衣壳蛋白(HBcAg全长)C183、单域抗体Lam6(识别红色荧光蛋白mCherry的单域抗体)和pcGBP1(表面阳离子改造的GFP单域抗体)等非融合状态下在***系统中表达量低的靶蛋白为示例,分别在ER2566、BL21、SHuffle T7 ***等大肠杆菌菌株中进行表达,SDS-PAGE结果表明S1 1标签对三种靶蛋白均具有提高表达量的作用。对比T7融合标签分析,Dot-blotting结果显示与无融合的C183相比,S11标签融合表达对重组蛋白相对表达量的提高约4倍,与T7标签基本相当或者更优。(2)通过透射电镜(TEM)观察和冷冻电子显微镜(cryo-EM)3D结构重建对C183蛋白的VLP颗粒进行分析,颗粒形态和三维结构的结果表明融合S11标签并不影响重组蛋白的结构表征。此外,利用S11标签与sfGFP1-10蛋白这两个sp1it-GFP片段在可溶状态下能够自发组合形成一个完整的sfGFP,并发出绿色荧光的特性,我们在Hep2细胞(喉癌细胞)中进行单域抗体GSN11的免疫荧光实验,结果表明S11标签不会影响重组蛋白的功能。(3)我们通过原始S11多肽进行N端和C端的系列截短,进一步研究S11标签中提高重组蛋白表达的关键氨基酸序列。在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白,进行SDS-PAGE和Dot-blotting实验分析,结果表明S11标签中间仅包含9个氨基酸的Snc5标签序列(MVLHEYVNA)即具备与原始标签相当的功能,且Snc5标签与sfGFP1-10蛋白反应无绿色荧光产生,表明Snc5标签包含的9个氨基酸是提高重组蛋白表达水平的核心序列,但不是与sfGFP1-10蛋白形成完整sfGFP的功能序列。总之,本研究发展了能提高重组蛋白在以***中表达水平的新型短肽标签(S11和Snc5),对多个在非融合状态下原始表达量较低的蛋白进行测试的结果均证明了其能显著提高目的蛋白表达水平,融合该标签进行重组表达也未观察到对目的蛋白的折叠和功能造成明显影响。本研究发展的以S11和Snc5为代表的短肽融合标签,将为重组蛋白表达纯化及蛋白质结构与功能的研究提供新的工具。

关键词：原核表达系统大肠杆菌重组蛋白融合标签表达水平

氨基甲酸乙酯水解酶可溶性表达及其酶学性质研究

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食品与发酵工业 2024年第3期50卷 59-66页

作者：刘凤松李亚杰李亚贤龙梦飞陆智无限极(中国)有限公司广东广州510405 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)是一种主要存在于发酵食品和酒精饮料中对人体有潜在致癌性的有害物质,EC水解酶能够有效地消减EC,但其存在异源表达量较低、乙醇耐受性较差等问题。该研究结合计算机辅助改造与基于机器学习的融合标签... 详细信息

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)是一种主要存在于发酵食品和酒精饮料中对人体有潜在致癌性的有害物质,EC水解酶能够有效地消减EC,但其存在异源表达量较低、乙醇耐受性较差等问题。该研究结合计算机辅助改造与基于机器学习的融合标签设计等手段对赖氨酸芽孢杆菌来源的EC水解酶进行改造及优化。首先利用PROSS计算程序改造EC水解酶提高其乙醇耐受性,其次基于支持向量机回归的机器学习模型设计促溶标签提高其可溶性表达。基于PROSS筛选获得了组合突变体S21E/H197Y/Q328C/P348I(EC4),其酶活力相较于野生型提高了1.55倍,20%(体积分数)乙醇条件下的相对酶活力较野生型提高了约2.56倍。进一步筛选了合适的短促溶标签获得可溶性表达提高最多的是SVM1-EC4,其酶活力约为野生型的1.82倍,15%(体积分数)乙醇下的相对酶活力是野生型的3.99倍,且在模拟酒样中水解EC效果是野生型的2.07倍。总之,计算与融合标签相结合对EC水解酶进行改造能够有效地提高其可溶性表达及乙醇耐受性,为其工业应用提供了一定的理论依据和技术基础。

关键词：氨基甲酸乙酯水解酶可溶性表达乙醇耐受性融合标签 PROSS计算机器学习

人工蛋白XXA促进人源肿瘤抑素Tumstatin可溶性表达

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食品与发酵工业 2024年第12期50卷 1-8页

作者：敖龙朱玲玉庞欣辛瑜郭忠鹏朱瑞李默影顾正华郭自涛张梁江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122 江苏大学食品与生物工程学院江苏镇江212013

为实现人源肿瘤抑素Tumstatin在大肠杆菌中的可溶性表达,构建了5种不同促溶性融合标签与tumstatin基因融合表达的重组大肠杆菌BL21(DE3),利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导重组菌进行摇瓶发... 详细信息

为实现人源肿瘤抑素Tumstatin在大肠杆菌中的可溶性表达,构建了5种不同促溶性融合标签与tumstatin基因融合表达的重组大肠杆菌BL21(DE3),利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导重组菌进行摇瓶发酵,利用SDS-PAGE和Western-Blot分析并筛选出能可溶性表达Tumstatin蛋白的重组菌。构建的重组菌中BL21/pGEX-6p-1-Tum(含谷胱甘肽巯基转移酶标签—GST标签)、BL21/pET28a-MBP-Tum(含麦芽糖结合蛋白标签—MBP标签)、BL21/pET28a-Tum(无标签)都是以包涵体的形式表达融合蛋白Tumstatin,只有重组菌BL21/pET28a-XXA-Tum(含抗冻蛋白的反向蛋白—XXA标签)能以可溶性的形式表达融合蛋白且目的蛋白占菌体总蛋白45%以上。利用亲和层析对目的蛋白进行纯化并进行Western-Blot分析,得到分子质量为50.9 kDa的目的条带,与理论分子质量一致。进一步对重组菌BL21/pET28a-XXA-Tum的诱导剂添加浓度、诱导剂添加时间、诱导温度、诱导时间诱导条件进行优化。最终选择Tumstatin融合蛋白诱导条件为:诱导剂浓度0.1 mmol/L、2 h添加诱导剂、诱导温度16℃、诱导时间36 h。人源肿瘤抑素在大肠杆菌中可溶性表达为大量制备可溶性人源肿瘤抑素奠定了基础,可为功能性多肽在大肠杆菌中的可溶性表达提供借鉴。

关键词：人源肿瘤抑素大肠杆菌可溶性表达融合标签抗冻蛋白的反向蛋白

盘尾丝虫ASP1蛋白佐剂活性区不同标签融合表达与佐剂活性比较

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中国动物传染病学报 2019年第3期27卷 44-50页

作者：胡威卢会鹏张晓凯李洋洋张鑫宇夏晓莉孙怀昌扬州大学兽医学院江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009 江苏农牧科技职业学院泰州225300

为了探明纯化标签对盘尾丝虫活化相关分泌蛋白1(activation-associated secreted protein 1,ASP1)佐剂活性的影响,将其佐剂活性区PR-1编码序列分别与类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptide,ELP)、ELK16自聚肽或His标签进行融合表达,用相变循环、离心洗涤和镍亲和层析进行融合蛋白纯化;将ELP与传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2基因片段进行融合表达,用蛋白酶切除ELP标签后与不同标签融合PR-1免疫小鼠,两次免疫后不同时间采血分离血清,采用ELISA检测VP2特异IgG、IgG1和IgG2c滴度,用试剂盒检测免疫小鼠血清的IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10浓度。结果显示,ELP-PR1、ELK-PR1、His-PR1和ELP-VP2融合蛋白在重组大肠杆菌中均获得正确表达,纯化蛋白纯度大于90%;3种标签融合PR-1均能增强免疫小鼠的抗原特异IgG、IgG1和IgG2应答,并能刺激小鼠产生IFN-γ、TNF-α、IL-6或IL-10细胞因子。在3种PR-1融合蛋白中,ELP-PR1的佐剂活性最强,ELK-PR1与不完全弗氏佐剂相当。本研究探索了不同纯化标签对PR-1免疫佐剂活性的影响,为传染性法氏囊病新型亚单位疫苗佐剂研制提供思路。

关键词：盘尾丝虫活化相关分泌蛋白1 PR-1佐剂活性区融合标签佐剂

重组FLAG标签的融合表达纯化及亲和常数的测定

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科技通报 2010年第3期26卷 350-357页

作者：邹少林丁先锋郭江峰浙江理工大学生命科学学院杭州310018

构建了三种融合标签FLAG1(DYKDDDDK)、FLAG2(DYKDYKYK)和FLAG3(DYKGGGYK)的原核表达质粒pGEX-2t-His-NSH2-FLAG,以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,表达并纯化重组蛋白GST-His-NSH2-FLAG。生物信息学分析表明FLAG1的亲水性和抗原性较强,FLAG2次之,FLAG3最弱。Western blotting分析表明单抗M2能够识别此三种FLAG融合蛋白。非竞争性酶免疫法测得FLAG1、FLAG2和FLAG3结合单抗M2的亲和常数分别为0.077μM,0.102μM和0.126μM。相关工作为在多肽芯片上应用FLAG标签进行蛋白质相互作用的检测奠定了一定的基础。

关键词： FLAG 融合标签蛋白纯化亲和常数