蓝细菌融合标签技术分离纯化蛋白质方法的建立与优化

作     者：晋虎 

作者单位：天津大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张卫文;王冰

授予年度：2014年

学科分类：081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070303[理学-有机化学] 0703[理学-化学] 

主      题：蓝细菌 融合标签 亲和纯化 膜蛋白 脂肪酸去饱和酶 

摘      要：随着基因工程与合成生物学的发展，光合蓝细菌利用光能与CO2分别作为唯一的能源和碳源，已经可以合成生产多种生物能源与精细化学品，但是目前蓝细菌相关生物合成代谢途径的关键酶的研究信息不足严重限制了其应用潜力，蓝细菌的生产能力远远低于其他模式工程菌。为了解决这个问题，需要对蓝细菌生理代谢有更为深入的了解，而实现这一目标需要完成对细胞内重要功能蛋白质以及蛋白复合体的准确分析和定位。最近广泛应用于分离纯化蛋白质的融合标签技术为我们建立蓝细菌中蛋白质的分离纯化方法提供了一种思路，但分离纯化蛋白质常常受到细胞中蛋白质表达量的限制，尤其是蓝细菌中存在丰富的由类囊体膜、细胞膜以及外膜组成的生物膜系统，而且许多膜蛋白的表达量非常低，这给我们分离纯化其蛋白质带来了更大的困难，因此融合标签技术应用于蓝细菌中分离纯化蛋白质需要进行进一步的优化。 为了建立蓝细菌中蛋白质的分离纯化方法，本文以模式蓝细菌集胞藻PCC6803作为研究对象，选取其细胞中的膜蛋白Δ-6与Δ-9脂肪酸去饱和酶作为待分离纯化的目的蛋白质，利用融合PCR技术与同源重组双交换的方法，构建了在目的蛋白质C端分别插入His标签或者3×FLAG标签的突变株。利用融合标签的亲和纯化作用，我们成功分离得到了Δ-6与Δ-9脂肪酸去饱和酶，同时在比较His标签和3×FLAG标签的灵敏性，使用实时荧光定量PCR技术确定目的蛋白质表达量较高的时间点，利用超速离心法与非离子型去垢剂释放结合于膜上的目的蛋白质，以及放大培养集胞藻PCC6803以提高获得生物量几个方面对分离纯化方法进行了优化，同时我们尝试分离得到了Δ-9脂肪酸去饱和酶的蛋白质复合体。 本文初步在模式蓝细菌集胞藻PCC6803建立优化了融合标签分离纯化蛋白质的方法，为蓝细菌的生物合成代谢相关途径的关键酶的深入研究奠定了重要的技术基础。