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基于萜烯合酶家族分析的茶树β-石竹烯合酶筛选与功能验证

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基于萜烯合酶家族分析的茶树β-石竹烯合酶筛选与功能验证

作者：张尚蕊安徽农业大学

学位级别：硕士

茶树（Camellia sinensis L）是我国的重要的园艺类叶用经济作物。但是和其他经济作物一样,茶叶也面临着一定的虫害侵袭。同时,茶叶作为饮品的特殊性也使农药残留的问题更加突出。茶叶的质量与饮用安全是人们关注的重点。茶园病虫害危... 详细信息

茶树（Camellia sinensis L）是我国的重要的园艺类叶用经济作物。但是和其他经济作物一样,茶叶也面临着一定的虫害侵袭。同时,茶叶作为饮品的特殊性也使农药残留的问题更加突出。茶叶的质量与饮用安全是人们关注的重点。茶园病虫害危害严重,每年造成茶园减产15%～20%。茶树次生代谢产物不仅是茶叶特殊风味品质的物质基础,而且与茶树的病虫害防御密切相关。挥发性萜烯类化合物是植物花和果实中重要的香气活性物质,且具有重要的生理作用,参与茶树的直接或间接防御。因此,挖掘与萜类合成相关的基因对茶树病虫害绿色防控具有重要意义。茶树中已经鉴定了多个萜烯合酶,但是还有更多的TPS未被鉴定功能。为了对茶树中的萜烯合酶（Cs TPSs）进行全面了解,本研究通过对茶树基因组序列分析,发现了40个Cs TPSs。植物的萜烯合酶基因家族中共分为7个系统发育亚家族,茶树中包含5个。在此基础上,本研究又系统分析了茶树Cs TPS基因家族成员的进化关系、内显子与外显子的结构特点、保守结构域、其在不同茶树组织的表达及对茉莉酸甲酯的响应情况。基因表达分析表明,Cs TPSs在嫩芽、嫩叶和花中的表达量明显高于其他组织,这也与茶叶具有独特的风味相吻合。茶尺蠖取食可显著诱导茶树Cs TPS27合成并释放相关萜类化合物。GC-MS分析表明,茶尺蠖啃茶树叶片可合成多种萜类化合物,其中含有具有抗虫作用的β-石竹烯,而未被取食的茶树叶片没有或只有少量β-石竹烯合成,说明Cs TPS27可能在茶树的抗虫防御中具有一定的功能。为了进一步验证这些Cs TPSs的生物学功能,本研究筛选得到了一条对茉莉酸甲酯响应强烈的的相关基因Cs TPS27。利用PCR技术克隆到该基因的全长,进化树分析表明Cs TPS27属于TPS-a分支。将Cs TPS27全长连接到p GEX-4T1载体并转化大肠杆菌,表达得到重组蛋白。分别以GPP和FPP为底物进行体外酶活分析。结果表明Cs TPS27可利用FPP为底物在体外具有催化合成单环结构β-榄香烯、大根香叶烯、γ-榄香烯、α-摩勒烯和α-石竹烯;双环结构β-石竹烯、γ-摩勒烯、α-杜松烯、γ-杜松烯、δ-杜松烯和（+）-香橙烯,和三环结构α-古巴烯和α-毕茄澄烯。不能利用GPP为底物。说明Cs TPS27可能是一条多功能的倍半萜合成酶基因。茶树体内活性实验可能需要进一步完善。综上所述,本研究在系统分析了茶树Cs TPSs家族特点的基础上,揭示了Cs TPS27是一种新型的茶树倍半萜环化酶。该研究不仅有助对茶树Cs TPSs家族的认识,而且为茶树多种环化倍半萜的生物合成及调控提供了理论依据。

关键词：茶树萜烯合酶抗虫性功能鉴定 β-石竹烯

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红象牙杧果香气与萜烯合酶基因的挖掘

红象牙杧果香气与萜烯合酶基因的挖掘

作者：代学慧海南大学

学位级别：硕士

杧果(Manguifera indica L.)是我国重要的热带经济作物。杧果果实的成熟伴随着生理和生化过程,包括硬度、颜色和风味的改变。风味是决定杧果市场价值的重要标准,而果实的气味是风味的重要影响因素之一。然而,在育种和栽培的过程中,发现... 详细信息

杧果(Manguifera indica L.)是我国重要的热带经济作物。杧果果实的成熟伴随着生理和生化过程,包括硬度、颜色和风味的改变。风味是决定杧果市场价值的重要标准,而果实的气味是风味的重要影响因素之一。然而,在育种和栽培的过程中,发现杧果果实的香气会逐渐丢失,这使得杧果产业面临着新的挑战。在杧果的气味物质中,萜烯占据着含量最高、种类最丰富的重要地位。杧果的一生都与萜烯紧密相关,而萜烯在果实成熟的每个阶段都有着显著的变化。根据杧果基因组数据发表的相关背景,本研究主要以红象牙中的萜烯合成的关键基因TPS作为研究对象,利用分子生物学手段对杧果香气减少的原因进行探索。为了了解杧果成熟过程中关于萜烯的基本代谢过程的生物学机制,本研究以红象牙叶片作为研究对象,使用GC-MS对采后3 d、5 d、7 d等三个不同后熟阶段的红象牙杧果实的挥发性化合物进行检测。随着果实成熟度的增加,果实的风味越丰富,大部分的萜烯含量上升。其中,Terpinolene是红象牙果实中含量最高的挥发物,其相对含量在70%左右。同时,早期后熟阶段的果实不含α-Terpinene,但在红象牙果实成熟后期开始出现。与α-Terpinene变化趋势相反,Caryophyllene仅在红象牙后熟早期阶段的果实中被检测出。叶片中含有的挥发物Menogene和1-methylene-4-cyclohexane,在果肉中的含量却很少。在杧果果实中,萜烯展现出了成熟阶段特异性,并且具有组织特异性。我们从红象牙基因组中筛选了35个TPS基因进行生物信息特征分析和表达模式分析,并系统性的对35个TPS进行了克隆和功能验证。这35个基因中,大多数基因的长度在520-600个氨基酸之间,普遍比之前研究报道的TPS(600-900)短。除了大部分定位于胞质与质体外,还有个别TPS蛋白被预测定位至细胞核、内质网等细胞器中。这些发现说明TPS在杧果体系中可能存在独立进化。结合系统发育树、功能验证结果和基因在染色体上的定位结果,进一步证实了萜烯合酶无法根据序列来预测其功能的猜想,甚至在染色体上成簇存在的TPS基因的功能也不具有规律性。红象牙种大多数的TPS在果实中的表达量很低,并且在叶片中的表达量普遍高于在果实中的表达量。红象牙TPS的酶促反应结果显示,有13个TPS未显示出萜烯合酶活性。与番茄、葡萄等物种相比较,红象牙的TPS基因数量明显较少。有10个TPS能催化GPP产生单萜,其中7个TPS仅催化GPP;15个TPS能催化NPP产生单萜,其中10个TPS只能催化NPP;3个TPS能催化FPP产生倍半萜,并且这3个TPS能同时催化GPP或NPP产生单萜;没有TPS能催化GGPP产生二萜。有约1/3的TPS不具有功能活性,假TPS基因的数量比其它已进行基因家族表征的物种多,说明红象牙TPS家族存在功能丢失的可能。通过体外功能验证,结合基因表达模式和亚细胞定位的预测结果,我们分别对果实和叶片中主要萜烯化合物的生物合成起主要作用的TPS基因进行了分析。Terpinolene主要由Mi TPS013687合成。有6个TPS基因具有合成3-Carene的功能,红象牙中3-Carene的生物合成是多个基因共同协作的结果。Mi TPS016652是合成果肉特异性香气(S)-(1)-β-Pinene主要基因。Mi TPS029492主要负责果实中D-Limonene的生物合成,在叶片中D-Limonene的生物合成主要由Mi TPS029492、Mi TPS030550参与。Mi TPS013695能够参与叶片中1-methylene-4-cyclohexane的生物合成。Mi TPS029716、Mi TPS012261主要负责叶片中Menogene的生物合成。这些主要挥发物的相关合成基因的推测为杧果香味育种的核心种质的筛选提供分子生物学基础。总结实验结果,我们推测杧果香气丢失的主要原因有:杧果在长期生产、育种中TPS基因可能存在功能丧失的改变;由于基因功能的改变需要长时间的积累,因此杧果香气丢失更有可能是因为果实中许多TPS没有表达,或者表达量很低。本研究对杧果中含量最丰富的化合物萜烯的生物合成关键酶——TPS进行了家族分析,并对其功能活性进行了体外鉴定。该研究不仅有助于对杧果TPS家族的认识,更为优质香型的杧果的选育提供了分子生物学基础。更重要的是,这为杧果香气丢失的原因进行了初步探索,并有利于进一步解决杧果香气的品质问题。

关键词：杧果香气红象牙萜烯合酶原核表达功能鉴定主要香气的关键基因

‘海黄’牡丹花挥发物测定及部分萜烯合酶基因功能研究

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‘海黄’牡丹花挥发物测定及部分萜烯合酶基因功能研究

作者：李瑞雅河南科技大学

学位级别：硕士

牡丹(Paeonia section Moutan DC.)是我国传统名花,其花大而美,具有极高的观赏价值,‘海黄’牡丹作为牡丹黄色系的一个晚开品种,因其花期较晚、颜色纯正、花香浓郁,具有重要的应用价值。植物挥发物是由植物体内合成并释放到空气中的多... 详细信息

牡丹(Paeonia section Moutan DC.)是我国传统名花,其花大而美,具有极高的观赏价值,‘海黄’牡丹作为牡丹黄色系的一个晚开品种,因其花期较晚、颜色纯正、花香浓郁,具有重要的应用价值。植物挥发物是由植物体内合成并释放到空气中的多种挥发性成分,花挥发物主要来源于花器官,是花卉的一个重要品质指标。近年观赏植物的花挥发物研究已取得一定进展,但是在牡丹中的研究及应用仍较匮乏。本研究分析‘海黄’牡丹花挥发物成分和相对含量的变化规律,克隆并鉴定了部分萜烯合酶基因。主要结果如下:1.在‘海黄’牡丹中共检测出34种挥发物,不同花期花挥发物的释放量为盛开期>初开期>衰败期>绽口期,在花的不同器官中花瓣相对含量最高,日变化规律为先上升后下降,在14:00-16:00时间段达到峰值,其中芳樟醇、2,6-辛二烯-1-二醇,-3,7-二甲基、大根香叶烯D等化合物是‘海黄’牡丹花挥发物质主要成分。2.克隆并鉴定了‘海黄’牡丹芳樟醇合酶(Linalool synthase,Ps LIS)基因和大根香叶烯D合酶(Germacrene D synthase,Ps GDS)基因,Ps LIS全长为1698 bp,编码565个氨基酸,Ps GDS开放阅读框为1725 bp,编码574个氨基酸。Ps LIS、Ps GDS均为不稳定亲水、非跨膜、非分泌蛋白,有1个萜烯环化酶类保守结构域,并且定位于细胞质中。系统进化分析表明牡丹中Ps LIS、Ps GDS蛋白与木本植物的进化关系较近,与草本植物的进化关系较远。*** LIS、Ps GDS在花瓣中表达量显著高于花萼、雄蕊和雌蕊;Ps LIS在盛开期为最高,而Ps GDS在初开期表达量最高;日变化中,Ps LIS在14:00-16:00表达量最高,Ps GDS在12:00-14:00表达量最高。并且,Ps LIS、Ps GDS基因表达表达水平分别与芳樟醇、大根香叶烯D相对释放规律一致,且具有显著相关性,推测Ps LIS、Ps GDS可能是控制‘海黄’牡丹芳樟醇、大根香叶烯D化合物挥发量的关键基因。4.亚细胞定位试验结果Ps LIS、Ps GDS蛋白主要是定位在细胞质中,表明其功能的发挥是在细胞质中。5.构建35S::Ps LIS、35S::Ps GDS表达载体,转入农杆菌,叶盘法进行烟草的遗传转化,经鉴定得到3个Ps LIS阳性株系、3个Ps GDS阳性株系,其表达量均高于野生型,其中Ps LIS最高的表达量是野生型的4.92倍,Ps GDS最高的表达量是野生型的5.2倍。综上所述,本研究揭示了‘海黄’牡丹花挥发物释放规律,首次在牡丹中克隆得到Ps LIS基因Ps GDS基因,并进行生物信息学、表达模式和亚细胞定位分析,获得了过表达烟草遗传转化植株,为进一步解析牡丹花挥发物产生的分子机制,培育不同香型牡丹提供一定的理论参考。

关键词：牡丹花挥发物萜烯合酶芳樟醇合酶大根香叶烯D合酶

水稻叶子挥发性萜类化合物在紫外胁迫下含量的变化及相关萜烯合酶的研究

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水稻叶子挥发性萜类化合物在紫外胁迫下含量的变化及相关萜烯合酶...

作者：殷焕然湖北大学

学位级别：硕士

萜类化合物是自然界中种类最多的次生代谢产物,高等植物、微生物、昆虫以及海洋生物等均有萜类化合物存在。它在生物体内具有重要的生理功能,参与了植物对各种逆境的抗逆反应(如虫害等),同时也作为生物体间的信号物质在植物授粉传播种... 详细信息

萜类化合物是自然界中种类最多的次生代谢产物,高等植物、微生物、昆虫以及海洋生物等均有萜类化合物存在。它在生物体内具有重要的生理功能,参与了植物对各种逆境的抗逆反应(如虫害等),同时也作为生物体间的信号物质在植物授粉传播种子等过程中起着重要的作用。自然界中丰富多样的萜类物质同时也是人类工业生产以及药物研发的巨大宝库,很多萜类物质是工业上的重要原材料,还有一些作为药物来预防和治疗各种各样的疾病。而对于萜类化合物的研究一直以来都是生命科学研究的热点。目前,主要关于植物体内的萜类化合物的研究主要集中在其功能及相关合成途径的研究,已有的研究结果表明萜类物质在植物的直接防御与间接防御中起到了重要作用。近年来,萜类化合物除了在很多生物胁迫下的功能被相继报道以外,其在非生物胁迫下的功能研究也开始被学者们关注。随着地球臭氧层的破坏,紫外(UV)辐射作为一种非生物胁迫对植物的生理生态研究逐渐被学者们重视。水稻是人类重要的粮食作物,其产量及品质一直是作物研究方向的重点。由于水稻的产量及品质会受到环境较大的影响,萜类化合物作为植物体内的抗逆储备物质,因此对水稻中萜类物质在UV-B胁迫下的功能研究就有着非常重大的意义。在本研究中,我们用气相色谱质谱联用(GC-MS)检测并鉴定了水稻叶子中的8种挥发性萜类化合物,其中单萜类化合物有α-蒎烯、β-月桂烯、柠檬烯、罗勒烯、芳樟醇、香叶醇6种,倍半萜类化合物有trans-橙花叔醇和trans-金合欢醇2种。对水稻叶子中这8种挥发性萜类化合物进行定量分析,结果表明倍半萜trans-金合欢醇为水稻叶子中单萜倍半萜类物质的主要成分(74.93%)。而在对水稻三叶期幼苗进行UV-B诱导12h后,水稻叶片中的香叶醇和trans-金合欢醇的含量有着显著的提高。由于萜烯合酶作为萜类化合物合成途径中的关键酶,因此其表达量对于植物体内萜类物质的含量有重要影响。通过对水稻萜烯合酶(OsTPS)转录水平的检测,我们找到了 3个在UV-B诱导后表达量显著上升的OsTPS,分别为OsTPS1、OsTPS28和OsTPS30。亚细胞定位实验证明,这三个酶都定位于细胞质。对这三个酶进行原核表达纯化及体外酶活测试,发现OsTPS 1具有trans-橙花叔醇合成酶与trans-金合欢醇合成酶的倍半蔽酶活性,OsTPS28具有trans-橙花叔醇合成酶的倍半萜酶活性,OsTPS30具有香叶醇合成酶的单萜酶活性以及trans-金合欢醇的倍半萜酶活性。对这三种酶的进化树分析表明这三种酶均属于TPS-a类。以上结果表明,OsTPS1与OsTPS30基因可能在水稻受到UV-B胁迫后被诱导表达,从而使水稻体内积累更多的trans-金合欢醇,参与水稻对UV-B胁迫的抗逆反应。

关键词：水稻挥发性萜类化合物紫外辐射萜烯合酶

紫薇属萜烯合酶基因克隆、表达与蛋白功能分析

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紫薇属萜烯合酶基因克隆、表达与蛋白功能分析

作者：章寒北京林业大学

学位级别：硕士

紫薇属香花物种尾叶紫薇(Lagerstroemia caudata)与无香型紫薇‘白云映霞’(***‘Baiyunyingxia’)均为白花,单萜类物质是二者盛开期花朵的主要差异挥发性成分,但在紫薇属中该类物质生物合成相关基因及功能尚不明确,为解析紫薇属单萜类... 详细信息

紫薇属香花物种尾叶紫薇(Lagerstroemia caudata)与无香型紫薇‘白云映霞’(***‘Baiyunyingxia’)均为白花,单萜类物质是二者盛开期花朵的主要差异挥发性成分,但在紫薇属中该类物质生物合成相关基因及功能尚不明确,为解析紫薇属单萜类物质生物合成的分子机制,本论文对尾叶紫薇进行全长转录组测序,筛选获得差异表达的萜烯合酶基因,以尾叶紫薇和紫薇‘白云映霞’为材料,分离萜烯合酶基因,分析基因的表达规律,并对其功能进行初步验证,主要结果如下:1.尾叶紫薇三个时期花朵的RNA混样进行全长转录组测序,获得了读长优于二代测序转录组的Unigene序列,数据库注释功能,检索了SSR位点及TFs家族,通过搜索萜烯合酶蛋白质保守结构域并结合二代转录组基因差异表达数据,筛选出与尾叶紫薇香气释放规律一致的两个基因Lc TPS1和Lc TPS14。2.在尾叶紫薇中分离了Lc TPS1和Lc TPS14,在紫薇‘白云映霞’中分离了同源序列Li TPS1和Li TPS14。Lc TPS1 CDS长1779 bp,编码592个氨基酸,Li TPS1 CDS长1776 bp,编码591个氨基酸,二者均含有萜烯合酶保守结构域RRXW、DDXXD及DTE/NSE,系统进化树将其归于TPS-b亚家族。Lc TPS14和Li TPS14基因长度均为1575 bp,编码525个氨基酸,二者含有DDXXD和DTE/NSE结构域,RRXW缺失,是典型的TPS-g亚家族成员。3.q RT-PCR结果显示Lc TPS1在尾叶紫薇盛开期表达量最高,而Li TPS1在紫薇‘白云映霞’未成熟花蕾时期表达量达到峰值。在盛开期花各部位,Lc TPS1在雌蕊中表达量较高,而Li TPS1在紫薇‘白云映霞’雄蕊中表达量较高。Lc TPS14和Li TPS14均在盛开期表达量最高,Lc TPS14在雌蕊中特异高表达,Li TPS14在花瓣及雌蕊中高表达,在其他部位中表达量较低。4.结合信号肽、转运肽、亚细胞定位预测,Lc TPS1和Li TPS1极有可能在质体表达,Lc TPS14和Li TPS14则预测在细胞质中表达,构建植物表达载体并通过本氏烟草叶片瞬时表达技术进行验证,Lc TPS1和Li TPS1定位于叶绿体,即其在质体上表达;Lc TPS14和Li TPS14在细胞质中表达。5.利用原核表达体系,构建不同原核载体,选择p ET30a表达融合蛋白,在上清中获得重组蛋白Lc TPS14、Li TPS14,在沉淀中获得Lc TPS1、Li TPS1包涵体。体外酶促反应结合GC-MS,重组蛋白Lc TPS14和Li TPS14催化GPP产生芳樟醇,催化FPP产生E-橙花叔醇,表明Lc TPS14、Li TPS14重组蛋白是具有双重催化功能的萜烯合酶。包涵体Lc TPS1、Li TPS1无生物学活性。本论文通过全长转录组数据筛选出与释香规律一致的萜烯合酶基因,并在尾叶紫薇和紫薇‘白云映霞’中成功分离基因,对其进行生物信息学分析,亚细胞定位及原核表达功能验证,进一步了解紫薇属植物花香生物合成分子机制,为紫薇花香育种提供依据。

关键词：紫薇属植物萜烯合酶表达分析亚细胞定位原核表达

环纹炭团菌挥发性气体对松材线虫的抑制活性及其萜烯合酶分析

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环纹炭团菌挥发性气体对松材线虫的抑制活性及其萜烯合酶分析

作者：李鸿昌中国林业科学研究院

学位级别：硕士

松材线虫病是松树的一种毁灭性病害,目前还不能完全控制其传播和扩散。真菌是生物防治松材线虫的一个新的途径,并已有文献证明了真菌的挥发性气体可以用于控制根结线虫。本研究测定了环纹炭团属真菌（Annulohypoxylon sp.）FPYF3050挥... 详细信息

松材线虫病是松树的一种毁灭性病害,目前还不能完全控制其传播和扩散。真菌是生物防治松材线虫的一个新的途径,并已有文献证明了真菌的挥发性气体可以用于控制根结线虫。本研究测定了环纹炭团属真菌（Annulohypoxylon sp.）FPYF3050挥发性气体（VOCs）对松材线虫的杀线作用。结果表明,环纹炭团菌VOCs对松材线虫具有明显的杀线效果,对繁殖型二龄幼虫（J2）和繁殖型混合龄期（mixed-stage）致死率分别为64.1%和58.4%,但是对卵并没有明显的抑制作用。GC-MS测定培养皿中的挥发性气体物质发现,72小时处理之后,在加入松材线虫的处理组的培养皿中的桉叶油素是主要的挥发性气体物质,含量占气体总量的77.4%,高于无松材线虫的对照组和单独培养环纹炭团菌的对照组。本文还测定了2,5,10和15（μg/m L）浓度下桉叶油素精油的杀线作用,结果表明该物质在24h和48h的处理之后能够抑制39.8%～100%的线虫卵进入J2、对J2在各时间段均有82.9%以上的致死率,对混合龄期的松材线虫的也18.7%～91.9%的线虫死亡。本研究指出桉叶油素可能是环纹炭团菌释放的挥发性气体物质中对松材线虫起到关键杀线作用的物质。这为利用真菌活性挥发性气体生物防治松材线虫提供了一个潜在的可能。另外,在Annulohypoxylon ***3050的基因组信息的基础上,鉴定出萜烯合成酶家族基因成员19个。并通过GC-FID测定其1,8-cineole表达模式结合q PCR,初步推断Ann5和Ann15可能是控制1,8-cineole合酶表达的基因,为该物质在大肠杆菌表达体系中异源表达打下了基础。

关键词：挥发性气体松材线虫杀线活性环纹炭团菌 1,8-cineole 萜烯合酶

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链霉菌来源的萜烯合酶基因挖掘与功能研究

链霉菌来源的萜烯合酶基因挖掘与功能研究

作者：熊骄云南大学

学位级别：硕士

链霉菌是一种革兰氏阳性放线菌（Actinomycetes）,分类学上归于链霉菌属（Streptomyces）。该属的许多成员都能产生对人类具有重要意义的天然代谢物。截至目前,链霉菌来源的聚酮类及非核糖体多肽的相关研究已比较充分,但链霉菌来源的萜... 详细信息

链霉菌是一种革兰氏阳性放线菌（Actinomycetes）,分类学上归于链霉菌属（Streptomyces）。该属的许多成员都能产生对人类具有重要意义的天然代谢物。截至目前,链霉菌来源的聚酮类及非核糖体多肽的相关研究已比较充分,但链霉菌来源的萜类化合物鲜有报道。大多数有价值的萜类化合物主要来源植物和真菌,其日常用于香料、食用色素、药物等。本实验室前期分离到一株产磷氮霉素的的链霉菌,命名为Streptomyces auratus AGR0001。为全面了解该菌基因组背景信息,本课题对该菌株进行全基因组测序。利用Anti SMASH数据库对*** AGR0001基因组次级代谢产物基因簇进行预测,发现了33个次级代谢产物生物合成基因簇（Secondary metabolites biosynthetic gene *** BGC）,包括聚酮类、萜烯类、核糖体多肽、非核糖体多肽等。通过对*** AGR0001的16株近缘菌株进行比较研究发现,在链霉菌基因组中,占比最大基因簇是聚酮类、NRP类和萜类,说明链霉菌对此三类天然产物具有很大的合成潜力。本文以萜类合酶为切入点,探索链霉菌合成萜类化合物的潜力。使用两次迭代的隐马尔可夫模型挖掘数据库中3943个链霉菌属基因组中的萜烯合酶,通过去冗余得到2471条萜烯合酶同源序列。结合结构域预测和保守基序分析,获得了11条P450和萜烯合酶结构域杂合的序列,并合成其中两条序列（TPS1和TPS2）,于大肠杆菌中进行原核表达验证。目前链霉菌来源的萜类化合物大多为二萜和倍半萜,课题将筛选出的两条序列连接至p Cold-TF质粒,分别与产FPP和GGPP的质粒在大肠杆菌中共表达,IPTG低温诱导发酵,GC-MS验证产物。两条序列均具有倍半萜合酶功能,TPS1表达菌发酵产物中检测到一个分子式为CH的倍半萜,TPS2表达菌发酵产物中检测到一个分子式为CHO的倍半萜。本课题通过比较基因组分析发现链霉菌中有较多的萜类生物合成基因簇（biosynthetic gene ***）,通过挖掘链霉菌属基因组中的萜烯合酶,发现链霉菌具有很好的合成萜类化合物的潜力,且有较多序列比较新颖的萜烯合酶,通过原核表达,证实了这些序列的功能。

关键词：链霉菌基因组挖掘比较基因组萜烯合酶

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百合花萜烯合酶基因的克隆

百合花萜烯合酶基因的克隆

‘圣心’杧果实TPS13基因表达分析及酶功能验证

生态文明建设中的植物学：现在与未来——中国植物学会第十五届会员代表大会暨八十周年学术年会

作者：李天骄郑健杨凯冷平生北京农学院园林学院北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室

根据GenBank发表的罗勒烯合酶基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE-PCR技术,从东方百合(Rosa chinensis)品种‘西伯利亚’盛开期的花瓣中获得了1个新的萜烯合酶基因。基因全长为1573bp,开放阅读框(ORF)为1449bp,编码483个氨基酸... 详细信息

根据GenBank发表的罗勒烯合酶基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE-PCR技术,从东方百合(Rosa chinensis)品种‘西伯利亚’盛开期的花瓣中获得了1个新的萜烯合酶基因。基因全长为1573bp,开放阅读框(ORF)为1449bp,编码483个氨基酸;蛋白质理论分子量为56.58KDa,等电点为4.98。氨基酸同源性分析表明,该蛋白与六出花AlstroTPS的氨基酸同源性达到53%,与小苍兰芳樟醇合酶的同源性为53%,与姜花芳樟醇合酶的同源性为50%。

关键词：西伯利亚百合萜烯合酶基因克隆

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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分子植物育种 2024年第4期22卷 1058-1065页

作者：王明珠王亮霍婷黄小镂丛汉卿罗海燕乔飞姜成东海南大学园艺学院海口570208 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所海口571101

为了探索‘圣心’杧品种中萜烯合酶基因功能,本研究以‘圣心’杧果肉为实验材料,利用同源克隆技术克隆到一个具有产生萜烯类物质功能的基因,并在原核表达体系中诱导纯化出该基因的蛋白,添加前体物质进行酶促反应后,通过气相色谱质谱联用... 详细信息

为了探索‘圣心’杧品种中萜烯合酶基因功能,本研究以‘圣心’杧果肉为实验材料,利用同源克隆技术克隆到一个具有产生萜烯类物质功能的基因,并在原核表达体系中诱导纯化出该基因的蛋白,添加前体物质进行酶促反应后,通过气相色谱质谱联用(GC-MS)上机检测该基因的产物。结果表明,在‘圣心’杧果肉中进行扩增得到一个产生萜烯类物质的基因,命名为TPS13,该基因长度在1692 bp,编码563个氨基酸,通过在线网站预测TPS13属于亲水性,不稳定蛋白,理论等电点(pI)值为5.51,说明该蛋白为酸性蛋白。通过对其结构域预测分析:TPS13蛋白的第52~540位氨基酸区间内包含一个天冬氨酸基序的cd00684结构域,属于Ⅰ类萜烯环化酶超家族。酶活性鉴定表明,该基因无法与底物GPP、FPP和GGPP生成产物,具有催化单萜类底物(NPP)生成产物柠檬烯以及α-松油醇。本试验结果为进一步研究杧果萜类物质提供参考依据。

关键词： ‘圣心’杧萜烯合酶生物信息学分析原核表达