链霉菌来源的萜烯合酶基因挖掘与功能研究

作     者：熊骄 

作者单位：云南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李铭刚

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 081703[工学-生物化工] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 090102[农学-作物遗传育种] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：链霉菌 基因组挖掘 比较基因组 萜烯合酶 

摘      要：链霉菌是一种革兰氏阳性放线菌（Actinomycetes）,分类学上归于链霉菌属（Streptomyces）。该属的许多成员都能产生对人类具有重要意义的天然代谢物。截至目前,链霉菌来源的聚酮类及非核糖体多肽的相关研究已比较充分,但链霉菌来源的萜类化合物鲜有报道。大多数有价值的萜类化合物主要来源植物和真菌,其日常用于香料、食用色素、药物等。本实验室前期分离到一株产磷氮霉素的的链霉菌,命名为Streptomyces auratus AGR0001。为全面了解该菌基因组背景信息,本课题对该菌株进行全基因组测序。利用Anti SMASH数据库对*** AGR0001基因组次级代谢产物基因簇进行预测,发现了33个次级代谢产物生物合成基因簇（Secondary metabolites biosynthetic gene *** BGC）,包括聚酮类、萜烯类、核糖体多肽、非核糖体多肽等。通过对*** AGR0001的16株近缘菌株进行比较研究发现,在链霉菌基因组中,占比最大基因簇是聚酮类、NRP类和萜类,说明链霉菌对此三类天然产物具有很大的合成潜力。本文以萜类合酶为切入点,探索链霉菌合成萜类化合物的潜力。使用两次迭代的隐马尔可夫模型挖掘数据库中3943个链霉菌属基因组中的萜烯合酶,通过去冗余得到2471条萜烯合酶同源序列。结合结构域预测和保守基序分析,获得了11条P450和萜烯合酶结构域杂合的序列,并合成其中两条序列（TPS1和TPS2）,于大肠杆菌中进行原核表达验证。目前链霉菌来源的萜类化合物大多为二萜和倍半萜,课题将筛选出的两条序列连接至p Cold-TF质粒,分别与产FPP和GGPP的质粒在大肠杆菌中共表达,IPTG低温诱导发酵,GC-MS验证产物。两条序列均具有倍半萜合酶功能,TPS1表达菌发酵产物中检测到一个分子式为CH的倍半萜,TPS2表达菌发酵产物中检测到一个分子式为CHO的倍半萜。本课题通过比较基因组分析发现链霉菌中有较多的萜类生物合成基因簇（biosynthetic gene ***）,通过挖掘链霉菌属基因组中的萜烯合酶,发现链霉菌具有很好的合成萜类化合物的潜力,且有较多序列比较新颖的萜烯合酶,通过原核表达,证实了这些序列的功能。