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水稻磷脂酶PLDζ1在盐胁迫中的作用

水稻磷脂酶PLDζ1在盐胁迫中的作用

作者：吕玮鑫华中农业大学

学位级别：硕士

磷脂是生物膜的重要组成部分,某些脂质也是细胞内重要的信号分子。磷脂酶D(phospholipase D,PLD)催化磷脂产生信号分子磷脂酸(phosphatidic acid,PA)。研究表明拟南芥磷脂酶D在逆境胁迫中起着重要的作用。水稻有17个PLD成员,比拟南芥更... 详细信息

磷脂是生物膜的重要组成部分,某些脂质也是细胞内重要的信号分子。磷脂酶D(phospholipase D,PLD)催化磷脂产生信号分子磷脂酸(phosphatidic acid,PA)。研究表明拟南芥磷脂酶D在逆境胁迫中起着重要的作用。水稻有17个PLD成员,比拟南芥更为复杂多样,但水稻磷脂酶D在逆境胁迫中的作用及其分子调控有待探索。本研究主要分析了水稻PLDζ1在盐胁迫反应中的作用及其分子调控。分析表明PLDζ1在分蘖期和抽穗期的叶片中表达量较高,并且叶片中的PLDζ1能够被盐胁迫所诱导。观察在烟草叶片中瞬时表达的绿色荧光标签蛋白发现PLDζ1定位在内质网中。通过克隆PLD1和表达PLDζ1重组蛋白,分析其酶活特性。结果发现水稻PLDζ1需要PIP2激活,且不依赖钙离子,但受高浓度钙离子所抑制。为分析PLDζ1在植物生长和逆境胁迫中的作用,本研究分离了 PLDζ1突变体和创建超表达植株。结果表明PLDζ1缺失突变体在盐胁迫下生长明显受阻,株高和地上部鲜重都显著低于野生型,且叶片在盐胁迫下受损程度显著高于野生型;而PLDζ1超表达植株的耐盐性明显高于野生型。同时还发现盐胁迫下PLDζ1缺失使钠离子外排蛋白相关基因的下调,以及钠离子内排蛋白相关基因的上调表达,并导致突变体体内钠离子含量显著高于野生型。施用PA形成抑制剂则可部分削减了突变体与野生型耐盐性的差异,表明PLDζ1产生的PA在耐盐性调控方面起了一定的作用。脂质代谢分析表明PLDζ1的缺失可导致多种脂质包括磷脂酸PA的变化。研究还发现PA能够与钠离子转运调控蛋白SOS3相互作用,同时也可与核糖体蛋白S6激酶(S6K1)互作。表明PLDζ1活性产生的PA与SOS3和S6K1互作而调控盐胁迫下的离子平衡和植株生长,从而增强植株的耐盐性。

关键词：水稻磷脂酶Dζ1 盐胁迫磷脂酸脂质代谢

海洋Moritella sp. JT01磷脂酶D的结构及其突变体的生化特性研究

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海洋Moritella sp. JT01磷脂酶D的结构及其突变体的生化特性研究

作者：毛雪静华南理工大学

学位级别：硕士

磷脂酶D(EC 3.***.4.4)是用于磷脂改性的重要工具酶之一,在食品、医药、日化等行业有着广泛的应用前景,开展磷脂酶D的挖掘及酶学特性研究具有重要意义。本课题组前期通过基因挖掘获得一种海洋Moritella ***01磷脂酶D(Ms PLD),对其进行了... 详细信息

磷脂酶D(EC 3.***.4.4)是用于磷脂改性的重要工具酶之一,在食品、医药、日化等行业有着广泛的应用前景,开展磷脂酶D的挖掘及酶学特性研究具有重要意义。本课题组前期通过基因挖掘获得一种海洋Moritella ***01磷脂酶D(Ms PLD),对其进行了原核重组表达和酶学性质研究,并发现其在催化合成磷脂酸方面具有应用潜力。本研究在前期工作的基础上,尝试对Ms PLD的三维结构进行解析,进一步基于结构和生物计算开展突变体理性设计并对各突变体的生化特性进行表征。相关研究为深入理解该酶的结构功能关系以及指导该酶的应用提供重要参考。具体开展的研究内容与获得的结果如下:(1)Ms PLD晶体结构解析在20%PEG1000,0.1 M磷酸氢二钠/柠檬酸p H 4.2,0.2 M硫酸锂的条件下获得了高质量的蛋白晶体,通过X射线衍射解析获得了分辨率为2.3(?)的Ms PLD晶体结构(PDB ID:7WU1)。Ms PLD的一个晶胞中含有六个蛋白分子,每个分子的结构基本一致,以对称规则的环形排列在晶胞中,每个蛋白分子整体呈现β-α-β-α-β的“三明治结构”,由12个α螺旋和21个β折叠片组成。蛋白一级序列中具有两个高度保守的HKD基序。将Ms PLD与链霉菌来源的PMF PLD(PDB ID:1F0I)和Sa PLD(PDB ID:2ZE4)进行对比,发现虽然其在一级序列上一致性较低(分别为21.83%和22.09%,低于30%),但它们催化活性中心的保守氨基酸HKD在空间排布上高度重合。(2)基于结构和分子动力学模拟计算改造提升Ms PLD的热稳定性基于Ms PLD的晶体结构,通过分子动力学模拟获得该酶结构中的不稳定区域信息,进而采用在不稳定区域引入二硫键的策略来提高酶蛋白稳定性。以野生型质粒p ET-21a(+)-Ms PLD为模板,通过定点突变的方式引入半胱氨酸,最终获得15株突变体。筛选出Tm和半衰期较野生型有显著提升的突变体S148C-T206C和D225C-A328C,在此基础上将两对二硫键进行叠加突变,得到了突变体S148C-T206C/D225C-A328C。以大豆磷脂酰胆碱为底物,对叠加突变体在最适反应条件下的动力学参数进行测定,结果表明其kcat/K值是野生型的1.36倍,半衰期为野生型的3.15倍,在不影响该酶活力的同时极大的提高了Ms PLD的热稳定性;在催化合成磷脂酸的应用方面,S148C-T206C/D225C-A328C达到反应平衡的时间为2 h(转化率同样为86.0%),相较于野生型的6 h,反应时间缩短到原来的1/3。(3)Ms PLD结构中特殊Loop区对酶蛋白生化特性的影响研究将Ms PLD的结构与链霉菌来源的PLD(PMF PLD,Sa PLD)结构进行叠合,发现Ms PLD有一段特殊的Loop区域。为探究该Loop区是否会对Ms PLD酶蛋白生化特性产生影响,分别采用截短、替换和引入二硫键三种策略设计突变体。结果表明,截短突变体Del57-113和Del65-113及替换突变体Ms PLD-1F0I都检测不到对大豆磷脂酰胆碱的水解活力,说明特殊Loop区的完整性对于保持Ms PLD的酶活力非常重要。突变体N61C-R284C、E75C-A156C、K102C-S163C的酶活力都低于野生型,说明特殊Loop区柔性的下降也会造成Ms PLD的酶活力降低。基于磷脂酶作为界面酶的催化反应基本理论,进一步从酶蛋白界面吸附角度考察了该Loop区对于酶蛋白界面吸附特性的影响。发现Del57-113、Del65-113及Ms PLD-1F0I对大豆磷脂酰胆碱单分子层膜的结合能力(用协同因子a表示)由原来的0.35降低到0.22、0.10和0.29,最大插入压力MIP由野生型的31.52 m N/m分别降至23.86、27.40和28.43 m N/m(p磷脂膜上,进而发生催化反应。

关键词：磷脂酶D 晶体结构热稳定性二硫键界面吸附磷脂酸

水稻磷脂酶Dζ1在脂质代谢和盐胁迫反应中的作用

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水稻磷脂酶Dζ1在脂质代谢和盐胁迫反应中的作用

作者：周一梦华中农业大学

学位级别：硕士

磷脂是生物膜的重要组成部分,某些脂质也是细胞内重要的信号分子。磷脂酶D(phospholipase D,PLD)催化磷脂产生信号分子磷脂酸(phosphatidic acid,PA)。研究表明拟南芥磷脂酶D在逆境胁迫中起着重要的作用。水稻有17个PLD成员,在逆境胁迫... 详细信息

磷脂是生物膜的重要组成部分,某些脂质也是细胞内重要的信号分子。磷脂酶D(phospholipase D,PLD)催化磷脂产生信号分子磷脂酸(phosphatidic acid,PA)。研究表明拟南芥磷脂酶D在逆境胁迫中起着重要的作用。水稻有17个PLD成员,在逆境胁迫中的作用尚未清楚。本研究主要分析了水稻PLDζ1在盐胁迫反应中的作用。结果表明水稻PLDζ1在各种组织中均有表达,但在叶片和根部表达量较高。PLDζ1缺失导致植株耐盐性显著低于野生型(WT)。脂质代谢组分析结果表明PLDζ1缺失可导致多种磷脂组分发生改变,特别是不同组分的PA发生明显变化,其中pldζ1突变体中的34:2-、34:3-、36:4-PA含量显著低于WT,而含相应脂肪酸种类的PE和PS则出现相反趋势,表明PLDζ1在植株体内利用PE及PS作为底物形成PA。同时,脂质代谢分析结果发现PLDζ1缺失显著影响几种常见磷脂组分,而对糖脂如MGDG和DGDG含量的影响甚小。表明不同PLD在脂质代谢中的独特性,进而产生不同的生理效应。此外,本研究还初步分析了水稻PLD家族其它部分成员在盐胁迫中的作用,观察相关突变体在正常生长条件和盐胁迫下的表型,仅发现PLDβ2缺失突变体在正常生长条件下生长明显受阻,其余PLD突变体在正常生长条件并没有明显表型,一些突变体如pldα2和pldα3在盐胁迫下生长明显受到抑制。初步结果表明不同PLD成员之间功能的差异性和异质性。本研究还分析了PLD不同成员突变体及其野生型植株的PLD活性,结果预示PLDα1、PLDα3、PLDα6、PLDζ1、PLDβ1及PLDζ2的缺失均可导致PLD活性的显著降低。后续可利用这些突变体进一步确定PLD对PA形成的贡献率。

关键词：水稻磷脂酶D 盐胁迫磷脂酸脂质代谢

两种磷脂酶D的酶学性质表征及其结构解析研究

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两种磷脂酶D的酶学性质表征及其结构解析研究

作者：刘思雨华南理工大学

学位级别：硕士

磷脂酶D(phospholipase D,PLD)是一类催化磷酸二酯键水解和碱基交换的磷酸二酯酶,作为一种重要的磷脂改性工具酶,其在食品、医药和日化等行业中展现出巨大的应用价值。然而目前PLD酶蛋白资源开发不足,蛋白结构信息较为缺乏,严重阻碍了... 详细信息

磷脂酶D(phospholipase D,PLD)是一类催化磷酸二酯键水解和碱基交换的磷酸二酯酶,作为一种重要的磷脂改性工具酶,其在食品、医药和日化等行业中展现出巨大的应用价值。然而目前PLD酶蛋白资源开发不足,蛋白结构信息较为缺乏,严重阻碍了对该类酶的结构功能关系理解以及下游的催化应用研究。基于此,本论文以筛选获得的来源于普城沙雷氏菌AS9(Serratia plymuthica AS9)和南极细菌JT01(Moritella ***01)磷脂酶D(SpPLD和Ms PLD)为研究对象,对其进行重组表达纯化、酶学性质表征以及晶体结构解析,以期为深入理解该酶的结构功能关系以及基于结构的分子改造和下游应用提供指导。具体开展的研究内容与结果如下:(1)PLD的重组表达及酶学性质研究。分别构建SpPLD和Ms PLD的重组表达载体p ET21a-SpPLD和p ET21a-Ms PLD并转化至大肠杆菌SHuffle T7中,获得两种酶蛋白的重组表达菌株。在16℃以0.2 m M IPTG诱导,20 h后收集菌体,经超声破碎离心获得上清液后,采用Ni-NTA和凝胶过滤色谱柱纯化获得高纯度的目的蛋白,经SDS-PAGE检测,SpPLD和Ms PLD的分子量分别约为66.4 KDa和44.0 KDa,与理论预测结果相符。以大豆来源磷脂酰胆碱为底物,采用酶联比色法分别对两种酶蛋白进行酶学性质表征。结果显示:Ms PLD对该底物的最适反应温度和p H分别为35.0℃和8.0,测得酶活力为2182.36±11.10 U/g;在35℃条件下,Ms PLD的半衰期为110 min,在4℃条件下半衰期长达41天;该酶对终浓度为50%的有机溶剂(正己烷、乙醚和苯)和终浓度为1%的部分表面活性剂表现出良好的耐受性,于4℃处理1 h后,其残余酶活力仍保持80%以上。但SpPLD对该底物未表现出水解活性。(2)PLD催化合成磷脂酸的研究。尝试利用两相催化反应体系进行Ms PLD催化合成磷脂酸的应用研究,探讨反应体系中不同因素对磷脂酸生成量的影响,最终优化生成PA的最佳条件为:水相和苯比例为4:1,大豆卵磷脂浓度为40.0 mg/m L,加酶量为1.0 U,于30℃,800 rpm,反应8 h后,得到PA浓度为2.37 mg/m L。(3)PLD的晶体结构研究。对SpPLD进行结晶条件筛选和优化以获得优质晶体,在上海同步辐射光源进行衍射获得其晶体数据,分辨率为1.79?;同时获得SpPLD硒代蛋白晶体,收集其单波长反常散射(SAD)数据,经过相位解析,最终获得SpPLD的蛋白结构,PDB ID为7E0M。SpPLD整体结构呈β-α-β-α-β夹心结构,由15个β折叠片,12个α螺旋和一系列有序loop环组成单个不对称球状结构,并由两个高度保守的Hx Kxxxx D(HKD)催化基序组成催化活性中心。SpPLD与同一家族其它PLDs进行结构比对发现:其在HKD基序下游存在独特的GS-GT基序,以及组成其催化活性中心的loop结构与同一家族中的PLDs存在明显差异。相比于链霉菌来源的PLD(PDB ID:1F0I,2ZE4),其α9和β9之间的loop环较长,且呈现正电性;α10和α11之间对应的loop环则明显变短;此外,SpPLD C末端独特的loop结构参与构成该酶的催化活性中心。通过优化获得Ms PLD-PC晶体,结晶条件为:0.1 M HEPES sodium/HCl p H 7.4,0.8M Potassium sodium tartrate tetrahydrate,0.2μL Silver Bullets A4;经X射线衍射,分辨率约为2.7?。但由于缺乏硒代蛋白晶体数据,无法对Ms PLD的相位进行解析,暂未能获得其晶体结构。

关键词：磷脂酶D 酶学性质磷脂酸晶体结构

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饮用水生物处理的膜生态学研究进展

中国给水排水 2003年第6期19卷 29-31页

作者：于鑫张晓健王占生清华大学环境科学与工程系北京100084

　介绍了饮用水生物处理中生物膜的形成、形态和组成,并阐述了磷脂酸(PLFA)和分子生物学方法在生物膜生态学研究中的应用。

关键词：饮用水生物膜胞外多聚物磷脂酸

拟南芥磷脂酶D应答渗透胁迫和调控钙信号转导的分子机理

维普期刊数据库

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拟南芥磷脂酶D应答渗透胁迫和调控钙信号转导的分子机理

作者：朱晓芳南京农业大学

学位级别：硕士

随着全球变暖和生态环境的恶化,干旱和低温等极端天气越来越常见,极端外界环境对作物产量和品质造成了严重影响。逆境胁迫对植物生长造成严重危害,引发植物一系列生理生化功能紊乱和形态改变。应对这样的不良环境,植物也进化出一系列抵... 详细信息

随着全球变暖和生态环境的恶化,干旱和低温等极端天气越来越常见,极端外界环境对作物产量和品质造成了严重影响。逆境胁迫对植物生长造成严重危害,引发植物一系列生理生化功能紊乱和形态改变。应对这样的不良环境,植物也进化出一系列抵御不良环境的逆境应答机制,例如激素信号转导系统、SOS系统和抗氧化防护系统等。磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)是植物抵御非生物胁迫的重要酶类。PLD水解膜磷脂产生磷脂酸(Phosphatidic acid,PA),PLD/PA共同参与调控多种胁迫应答过程,因此深入揭示PLD/PA调控植物耐渗透胁迫的分子机制,对于农作物的抗逆分子遗传改良具有重要的意义。拟南芥基因组有12个PLD基因,根据蛋白结构和催化区域,分为PLDα(3)、PLDβ(2)、PLDγ(3)、PLDδ、PLDε 和 PLDζ(2)。其中,PLDα1 和PLDδ含量最多。本研究以模式植物拟南芥为实验材料,研究PLDα1和PLDδ对渗透胁迫下植物保卫细胞内钙信号以及气孔开度的影响。本课题组前期实验已确定NaCl、脱落酸(Abscisic acid,ABA)和 PA 处理野生型(Wild type,WT)和pldα1突变体幼苗后,WT钙离子浓度显著高于pldα1突变体;pld突变体中PLDα1基因的缺失引起植物体内PLD蛋白活性显著降低,而PLDα1和PLDδ基因双敲除突变体PLD活性更低;ESI-MS/MS测定结果表明pldα1 pldδ突变体中PA含量显著降低。本文研究发现,山梨醇处理拟南芥幼苗,WT气孔关闭,而pldα1 pldδ-1和pldα1pldδ-2双突变体气孔不关闭。利用钙离子专一性染料Fluo-3处理拟南芥幼苗后,再用300 mM山梨醇处理拟南芥幼苗,激光共聚焦显微镜观察发现,WT保卫细胞中的钙浓度显著上升,而pldα1 pldδ-1和pldα1 pldδ-2中钙离子浓度变化幅度相对较小。利用DAB对拟南芥幼苗进行处理,结果发现山梨醇处理后的WT和pldα1 pldδ-和pldα1 pldδ-2保卫细胞中H2O2浓度均升高,且突变体中的H2O2含量低于野生型。利用过氧化氢染料H2DCF处理拟南芥表皮条,激光共聚焦显微镜观察显示,随着山梨醇处理时间的增加,WT和pldα1 pldδ-1和pldα1 pldδ-2突变体中H2O2的含量逐渐接近,处理15min后WT与pldα1 pldδ-1、pldα1 pldδ-2突变体中中的H2O2的含量几乎相当。利用H2O2染料H2DCF处理拟南芥表皮条,激光共聚焦显微镜观察显示,随着山梨醇处理时间的延长,WT和pld突变体中H2O2浓度随之升高且逐渐接近,处理5 min后pldα1 pldδ-1、pldα1 pldδ-2突变体保卫细胞的H2O2含量只有110左右,是WT保卫细胞的2/3;而处理15 min后,WT和pldα1pldδ双突变体的H2O2浓度几乎相当。200mM sorbitol处理WT和pldα1 pldδ双突变体,突变体主根生长明显被抑制。实验结果表明PLDα1和PLDδ基因的缺失大大降低了拟南芥保卫细胞和主根对渗透胁迫的敏感性,PLDα1和PLDδ参与渗透胁迫下拟南芥保卫细胞钙离子和H2O2的释放,进而调控气孔关闭。拟南芥OSCA1.1被确定为质膜渗透压控制的非选择性钙离子通道。前期实验已证明OSCA1.1参与山梨醇诱导的拟南芥气孔运动,且在植物的花、茎、叶、种子中均有表达。本课题为了探究拟南芥OSCA1亚家族各基因的功能及其相互之间的关系,提取了拟南芥OSCA1亚家族OSCA1.1～OSCA1.8在内的八个成员的基因和蛋白序列。通过生物信息学分析发现该亚家族基因分别位于拟南芥10条染色体中的三条上。且这八个成员结构高度保守,均含有胁迫相关顺式作用元件,暗示拟南芥OSCA1亚家族在帮助植物抵御干旱、冷害、盐胁迫等逆境方面发挥重要作用。通过GEO网站提取渗透胁迫处理后的拟南芥各组织部位OSCA1亚家族各基因表达量并绘制热图,结果表明,OSCA1.1、OSCA1.2以及OSCA1.8在渗透胁迫下有较高的表达量,而OSCA1.4和OSCA1.5的表达量较低。利用三引物法和RT-PCR技术鉴定出osca1.1和osca1.2纯合突变体,山梨醇处理后发现两者气孔均不关闭,且外源PA的添加不能恢复osca1.1和osca1.2的气孔关闭。利用脂印迹(Fat-blot)实验技术发现PA与OSCA1.1和OSCA1.2蛋白特异性结合与OSCA1.8不结合。利用点突变技术确定PA与OSCA1.1和OSCA1.2蛋白结合位点均为第743位的赖氨酸和744位的精氨酸。因此我们推测,OSCA1家族基因响应渗透胁迫,PA是调控该信号通路的重要信号分子。

关键词：拟南芥渗透胁迫磷脂酶D 钙离子磷脂酸

水稻甘油二酯激酶基因OsDAGK1以及磷脂酶C/甘油二酯激酶途径在抗病反应中的作用

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水稻甘油二酯激酶基因OsDAGK1以及磷脂酶C/甘油二酯激酶途径在抗...

作者：张卫东浙江大学

学位级别：硕士

磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)／甘油二酯激酶(diacylglycerol kinase，DAGK)信号是植物信号传导途径中一个极为重要的组分，在植物生长发育、逆境与激素反应以及抗病反应的信号传导途径中具有重要作用。本研究中，我们克隆和鉴定了一... 详细信息

磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)／甘油二酯激酶(diacylglycerol kinase，DAGK)信号是植物信号传导途径中一个极为重要的组分，在植物生长发育、逆境与激素反应以及抗病反应的信号传导途径中具有重要作用。本研究中，我们克隆和鉴定了一个水稻DAGK基因OsDAGK1;发现OsDAGK1在由苯并噻二唑(benzothiadiazole，BTH)诱发的诱导抗病性中激活表达，过量表达OsDAGK1的转基因烟草对烟草TMV和黑胫病菌表现出增强抗性;而且PLC／DAGK介导的信号途径参与BTH诱导的水稻细胞氧化进发、过敏性死亡以及抗病防卫反应。运用抑制性差减杂交法分离鉴定了200多个与BTH诱发的水稻诱导抗病性相关的差别表达基因克隆，其中的一个克隆可能是一个水稻DAGK基因的片段。采用快速扩增cDNA末端(RACE)技术，我们克隆鉴定了该水稻DAGK基因OsDAGK1全长cDNA。OsDAGK1全长cDNA序列为2012bp，含有一个1500 bp的ORF区域，预测编码一个499氨基酸组成的DAGK蛋白。OsDAGK1基因位于水稻4号染色体上，含有12外显子和11个内含子。进一步鉴定了水稻基因组中的其它7个DAGKs基因。根据推测的蛋白序列，所有OsDAGKs都包含一个300aa左右的保守DAGK催化结构域。EST随机性电子分析、RT-PCR和Northernblot表明，水稻DAGK基因的表达具有组织特异性，叶片中高度表达，根与种子中少量表达，茎和花中极少表达;而且在生物与非生物逆境反应中具有差别表达特性，OsDAGK1在BTH诱发处理并接种稻瘟病菌的水稻叶片中能快速激活表达，而且维持较长时间的高水平表达。为了进一步明确OsDAGK1在水稻抗病性中的作用，我们将OsDAGK1基因编码区置于植物双元载体CHF3中CaMV 35S组成型强表达启动子的下游，运用根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草，经卡那霉素抗性筛选和PCR检测获得12株OsDAGK1转基因植株。Southern分析表明OsDAGK1基因已成功整合到烟草基因组DNA中;Northern分析表明，转基因T代烟草植株都正常表达OsDAGK1基因。抗病性测定表明，过量表达OsDAGK1的转基因烟草植株提高了对烟草花叶病毒TMV和黑胫病菌(Phytophthora parasitica ***，Ppn)的抗病性。浙江大学硕士学位论文以水稻悬浮细胞一白叶枯病细菌互作为实验系统，进一步研究了BTH处理后水稻细胞中活性氧(active oxygen sPeeies，AOS)、过敏性细胞死亡、PLcfDAGK途径关键酶与有关转录因子和防卫反应相关基因的表达模式。结果表明，BTH可显著诱导水稻细胞AOS的产生和过敏性细胞死亡，处理后3一4小时活性氧产生到达最高峰，8小时细胞开始过敏性死亡。 BTH处理的水稻悬浮细胞中，白叶枯病细菌的侵染同样诱导了氧化迸发及过敏性细胞死亡，而超氧物歧化酶(superoxide dismutase，SoD)、过氧化氢酶(eatalase，CAT)、黄酮以及N- 乙酞半肤氨酸等活性氧清除剂或抗氧化剂显著抑制BTH诱导的过敏性细胞死亡，表明AOS 在BTH诱导的水稻HR细胞死亡中起重要作用。BTH单独处理或者BTH处理再接种白叶枯病细菌均能激活水稻悬浮细胞中PLC心AGK途径基因甘油二脂激酶基因口‘刀注G尤I和肌醇磷酸专化性磷酸酶C基因Os于)I二PLCI以及乙烯应答转录因子基因OsE火F7和葡聚糖酶基因OsBIG饭了表达。磷脂酸(phosphatidic acid，队)直接处理水稻悬浮细胞也能诱导氧化迸发及细胞过敏性坏死，而PLC抑制剂新霉素处理抑制以产生后一定程度抑制口‘叼G尤了、 OsERF7、乙坛刀力弓lul基因的表达以及BTH诱导的水稻悬浮细胞氧化进发以及细胞过敏性死亡。这些结果说明PLC心AGK介导的信号途径在 BTH诱导水稻AOS的产生以及过敏性细胞死亡信号传导途径中具有重要作用。

关键词：水稻(Oryza sativa L.) 烟草(Nicotiana tabacum L.) 苯并噻二唑诱导抗病性磷脂酸稻瘟病菌(Magnaporthe grisea) 白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae) 活性氧过敏性反应细胞死亡甘油二酯激酶磷脂酶C/甘油二酯激酶信号

拟南芥磷脂酶D调控AMT1;1和应答高铵胁迫的分子机理

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拟南芥磷脂酶D调控AMT1;1和应答高铵胁迫的分子机理

作者：刘晓南京农业大学

学位级别：硕士

氮是植物在生长发育过程中必不可少的大量元素之一,但作为植物两种氮源之一的铵对植物的毒害早在一个世纪前便有报道。由于人为、自然因素,地面土壤中的铵态氮浓度连年呈上升趋势,对农作物的产量和品质均产生不良影响。植物铵转运蛋白(A... 详细信息

氮是植物在生长发育过程中必不可少的大量元素之一,但作为植物两种氮源之一的铵对植物的毒害早在一个世纪前便有报道。由于人为、自然因素,地面土壤中的铵态氮浓度连年呈上升趋势,对农作物的产量和品质均产生不良影响。植物铵转运蛋白(Ammonium transporter,AMT)是重要的吸收和转运铵盐的家族,对调节植物的生长、发育具有重要作用。AMT1家族属于高亲和铵态氮转运蛋白,主要包括AMT1;1、AMT1;2、AMT1;3、AMT1;4和AMT1;5。其中,在低铵环境下,AMT1吸收与转运铵离子的分子机制研究已取得较大进展;但是,高铵胁迫下,AMT1如何主动减少铵离子吸收及其相关的分子调控机制,尚不清楚;磷脂酶是否参与该过程,也尚无报道。本研究以模式植物拟南芥为实验材料,研究了PLD和PA调控AMT1;1功能和应答高铵胁迫的分子机制。主要研究结果如下:首先,我们对拟南芥野生型(WT)和PLD双突变体(pldα1 pldδ-1和pldα1 pldδ-2)进行了50 m M高铵处理并统计其根伸长情况。研究结果表明,高铵处理显著抑制了主根伸长;与WT相比,pldα1 pldδ-1和pldα1 pldδ-2双突变体主根伸长受抑制的情况更加明显,其中,双突变体根分生区长度和细胞数目也显著减少;但外源添加PA显著缓解双突变体受抑制的情况。为了进一步研究PLD/PA对铵离子吸收的调控作用,我们用N标记的(NH)SO对WT和pldα1 pldδ进行短时间处理并检测幼苗体内(NH)SO含量。检测结果发现,与WT相比,拟南芥pldα1 pldδ-1幼苗体内(NH)SO的放射值显著升高,该结果与长时间铵处理检测的NH含量结果一致。上述实验表明,高铵胁迫下,PLDα1和PLDδ负调控植物对NH的吸收与转运。我们利用H标记的PC(磷脂酰胆碱)和专一性的酶反应缓冲液,测定了高铵胁迫对WT拟南芥幼苗中PLDα1和PLDδ蛋白活性的影响,同时,采用免疫印迹实验来检测高铵处理后PLD蛋白含量变化。实验结果表明,高铵处理显著诱导PLD活性的升高;在蛋白表达水平上,高铵胁迫处理对PLDα1蛋白表达无显著影响,而PLDδ蛋白表达量降低,表明高铵胁迫可能直接激活PLD,而不是通过诱导其蛋白表达来实现。另外,利用PA专一性分子探针(PABD)检测了高铵处理前后根细胞PA含量的变化。激光共聚焦荧光检测结果发现,50 m M NH处理12 h后,根细胞膜PA含量显著升高。上述结果表明,高铵胁迫下,PLD被激活产生PA,通过某种机制抑制植物根对铵离子的吸收与转运,从而调控植物的耐铵性。已有研究表明,在外界胁迫下,第二信使PA通过直接结合靶蛋白,调控其表达、定位、或活性,进而调节下游细胞信号转导和植物抗逆性。铵转运蛋白AMT家族在植物中负责NH胞外到胞内的转运,为了确定PA是否通过结合AMT调节植物感受与应答高铵胁迫,从拟南芥中克隆了AMT1;1-AMT1;5的CDS区域,并将其胞内编码区构建到带有GST标签的p GEX4T-1表达载体,在BL21大肠杆菌中表达蛋白并纯化。脂-蛋白结合实验结果发现,PA与AMT1;1结合能力最强,与AMT1;2、AMT1;3、AMT1;4较弱,与AMT1;5结合最弱。同时,利用蛋白点突变技术研究发现,AMT1;1第487位的精氨酸(Arg,R)是其与PA结合的关键位点。为了进一步验证该结合位点的准确性以及其功能,构建了野生型回补载体Pro :AMT1;1-GFP和点突变回补载体Pro :m AMT1;1-GFP,转基因到拟南芥AMT四突变体qko(amt1;1 amt1;2amt1;3 amt2;1),筛选到纯合体并进行50 m M甲基铵(Me A)处理。与已有研究结果一致,qko突变体表现为甲基铵不敏感表型。我们的研究发现,Pro :AMT1;1-GFP;qko回补材料与WT类似,耐高铵的能力显著减弱,而点突变回补材料Pro :m AMT1;1-GFP;qko的主根长度略短于qko,但显著长于WT和Pro :AMT1;1-GFP;qko幼苗。因此,我们推测,AMT1;1结合PA的第487位精氨酸可能是其转运铵离子的关键位点。PA如何结合该位点并调控植物吸收和转运铵离子及其相关分子机制,仍需进一步研究。总之,本研究发现了一条基于PLD/PA植物感受与应答高铵胁迫的信号通路。在高铵胁迫下,细胞内PLDα1和PLDδ蛋白被激活,产生信号分子PA,PA特异性结合AMT1;1并抑制其活性以减少胞内NH的吸收与转运,从而提高植物耐高铵能力。本研究初步明确了磷脂调控植物铵吸收和转运的关键靶标,为后期耐高铵作物的种质筛选及其分子遗传改良提供了理论基础和基因资源。

关键词：拟南芥高铵胁迫磷脂酶D 磷脂酸 AMT1 1

步长脑心通胶囊对脑血栓栓塞大鼠血浆磷脂水平的影响

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步长脑心通胶囊对脑血栓栓塞大鼠血浆磷脂水平的影响

作者：阎海娟山西医科大学

学位级别：硕士

目的:观察大鼠脑血栓形成后血浆溶血磷脂酸(LPA)和磷脂酸(PA)浓度的变化,以及步长脑心通胶囊对其影响。方法:采用颈内动脉直接插管注入凝血酶建立大鼠脑血栓栓塞模型,并预防性给予步长脑心通胶囊,观察大鼠脑血栓栓塞后溶血磷脂酸(LPA)... 详细信息

目的:观察大鼠脑血栓形成后血浆溶血磷脂酸(LPA)和磷脂酸(PA)浓度的变化,以及步长脑心通胶囊对其影响。方法:采用颈内动脉直接插管注入凝血酶建立大鼠脑血栓栓塞模型,并预防性给予步长脑心通胶囊,观察大鼠脑血栓栓塞后溶血磷脂酸(LPA)和磷脂酸(PA)的水平。具体方法如下:选取健康Wistar大鼠24只,随机分为4组,即正常对照组;实验对照组:药物试验组;假手术组,每组6只。24只大鼠均经腹主动脉取全血约4ml,检测LPA和PA:①实验对照组建立脑血栓栓塞模型(参照张兆岩等的方法并加以简化改进建立大鼠脑血栓栓塞模型),术后3小时采血检测;②药物试验组,术前每日0.48g/kg步长脑心通灌胃,共7天,其余过程同实验对照组;③正常对照组和假手术组也经腹主动脉取全血约4ml,检测LPA和PA;结果:实验对照组血浆LPA水平(12.47±1.65)umol/L与正常对照组(2.41±0.17)umol/L相比有很大程度的增高,药物试验组溶血磷脂酸(LPA)值(4.79±0.62)umol/L显著低于实验对照组(12.47±1.65)umol/L[P＜0.05]。实验对照组磷脂酸(PA)水平(10.51±0.98)umol/L较正常对照组(3.11±0.60)umol/L明显增高,即脑血栓大鼠血浆磷脂酸(PA)水平与正常对照组相比有很大程度的增高,而步长脑心通使脑血栓大鼠血浆磷脂酸(PA)水平降低(5.71±0.63)umol/L[P＜0.05];结论:大鼠脑血栓栓塞后血浆LPA和PA水平有不同程度增高,预防性给予脑心通胶囊可降低LPA水平,同时还可抑制血浆PA水平的增高。步长脑心通胶囊能够从多途径、多环节、多靶点阻断血栓形成,组方中的水蛭素是直接凝血酶抑制剂,丹参有ADP受体拮抗剂类似的生物效应,乳香、红花具有抑制血小板聚集,降低血液粘滞度的作用,全蝎、地龙有抗凝促纤溶作用,当归的水溶性成分阿魏酸能稳定血小板膜,抑制血小板环氧化酶活性,使血栓烷A(TXA)降低。该药对血液和血管双重奏效,在抗凝、降纤、溶栓方面发挥了重要作用,从而对血浆LPA和PA值起到修正作用。

关键词：步长脑心通胶囊脑血栓栓塞溶血磷脂酸磷脂酸大鼠