水稻甘油二酯激酶基因OsDAGK1以及磷脂酶C/甘油二酯激酶途径在抗病反应中的作用

作     者：张卫东 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋凤鸣

授予年度：2004年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：水稻(Oryza sativa L.) 烟草(Nicotiana tabacum L.) 苯并噻二唑 诱导抗病性 磷脂酸 稻瘟病菌(Magnaporthe grisea) 白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae) 活性氧 过敏性反应 细胞死亡 甘油二酯激酶 磷脂酶C/甘油二酯激酶信号 

摘      要：磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)／甘油二酯激酶(diacylglycerol kinase，DAGK)信号是植物信号传导途径中一个极为重要的组分，在植物生长发育、逆境与激素反应以及抗病反应的信号传导途径中具有重要作用。本研究中，我们克隆和鉴定了一个水稻DAGK基因OsDAGK1;发现OsDAGK1在由苯并噻二唑(benzothiadiazole，BTH)诱发的诱导抗病性中激活表达，过量表达OsDAGK1的转基因烟草对烟草TMV和黑胫病菌表现出增强抗性;而且PLC／DAGK介导的信号途径参与BTH诱导的水稻细胞氧化进发、过敏性死亡以及抗病防卫反应。 运用抑制性差减杂交法分离鉴定了200多个与BTH诱发的水稻诱导抗病性相关的差别表达基因克隆，其中的一个克隆可能是一个水稻DAGK基因的片段。采用快速扩增cDNA末端(RACE)技术，我们克隆鉴定了该水稻DAGK基因OsDAGK1全长cDNA。OsDAGK1全长cDNA序列为2012bp，含有一个1500 bp的ORF区域，预测编码一个499氨基酸组成的DAGK蛋白。OsDAGK1基因位于水稻4号染色体上，含有12外显子和11个内含子。进一步鉴定了水稻基因组中的其它7个DAGKs基因。根据推测的蛋白序列，所有OsDAGKs都包含一个300aa左右的保守DAGK催化结构域。EST随机性电子分析、RT-PCR和Northernblot表明，水稻DAGK基因的表达具有组织特异性，叶片中高度表达，根与种子中少量表达，茎和花中极少表达;而且在生物与非生物逆境反应中具有差别表达特性，OsDAGK1在BTH诱发处理并接种稻瘟病菌的水稻叶片中能快速激活表达，而且维持较长时间的高水平表达。 为了进一步明确OsDAGK1在水稻抗病性中的作用，我们将OsDAGK1基因编码区置于植物双元载体CHF3中CaMV 35S组成型强表达启动子的下游，运用根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草，经卡那霉素抗性筛选和PCR检测获得12株OsDAGK1转基因植株。Southern分析表明OsDAGK1基因已成功整合到烟草基因组DNA中;Northern分析表明，转基因T代烟草植株都正常表达OsDAGK1基因。抗病性测定表明，过量表达OsDAGK1的转基因烟草植株提高了对烟草花叶病毒TMV和黑胫病菌(Phytophthora parasitica ***，Ppn)的抗病性。 浙江大学硕士学位论文 以水稻悬浮细胞一白叶枯病细菌互作为实验系统，进一步研究了BTH处理后水稻细胞 中活性氧(active oxygen sPeeies，AOS)、过敏性细胞死亡、PLcfDAGK途径关键酶与有关转 录因子和防卫反应相关基因的表达模式。结果表明，BTH可显著诱导水稻细胞AOS的产生 和过敏性细胞死亡，处理后3一4小时活性氧产生到达最高峰，8小时细胞开始过敏性死亡。 BTH处理的水稻悬浮细胞中，白叶枯病细菌的侵染同样诱导了氧化迸发及过敏性细胞死亡， 而超氧物歧化酶(superoxide dismutase，SoD)、过氧化氢酶(eatalase，CAT)、黄酮以及N- 乙酞半肤氨酸等活性氧清除剂或抗氧化剂显著抑制BTH诱导的过敏性细胞死亡，表明AOS 在BTH诱导的水稻HR细胞死亡中起重要作用。BTH单独处理或者BTH处理再接种白叶 枯病细菌均能激活水稻悬浮细胞中PLC心AGK途径基因甘油二脂激酶基因口‘刀注G尤I和肌 醇磷酸专化性磷酸酶C基因Os于)I二PLCI以及乙烯应答转录因子基因OsE火F7和葡聚糖酶基 因OsBIG饭了表达。磷脂酸(phosphatidic acid，队)直接处理水稻悬浮细胞也能诱导氧化迸 发及细胞过敏性坏死，而PLC抑制剂新霉素处理抑制以产生后一定程度抑制口‘叼G尤了、 OsERF7、乙坛刀力弓lul基因的表达以及BTH诱导的水稻悬浮细胞氧化进发以及细胞过敏性死 亡。这些结果说明PLC心AGK介导的信号途径在 BTH诱导水稻AOS的产生以及过敏性细 胞死亡信号传导途径中具有重要作用。