拟南芥磷脂酶D调控AMT1;1和应答高铵胁迫的分子机理

作     者：刘晓 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张群

授予年度：2021年

学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 

主      题：拟南芥 高铵胁迫 磷脂酶D 磷脂酸 AMT1 1 

摘      要：氮是植物在生长发育过程中必不可少的大量元素之一,但作为植物两种氮源之一的铵对植物的毒害早在一个世纪前便有报道。由于人为、自然因素,地面土壤中的铵态氮浓度连年呈上升趋势,对农作物的产量和品质均产生不良影响。植物铵转运蛋白(Ammonium transporter,AMT)是重要的吸收和转运铵盐的家族,对调节植物的生长、发育具有重要作用。AMT1家族属于高亲和铵态氮转运蛋白,主要包括AMT1;1、AMT1;2、AMT1;3、AMT1;4和AMT1;5。其中,在低铵环境下,AMT1吸收与转运铵离子的分子机制研究已取得较大进展;但是,高铵胁迫下,AMT1如何主动减少铵离子吸收及其相关的分子调控机制,尚不清楚;磷脂酶是否参与该过程,也尚无报道。本研究以模式植物拟南芥为实验材料,研究了PLD和PA调控AMT1;1功能和应答高铵胁迫的分子机制。主要研究结果如下:首先,我们对拟南芥野生型(WT)和PLD双突变体(pldα1 pldδ-1和pldα1 pldδ-2)进行了50 m M高铵处理并统计其根伸长情况。研究结果表明,高铵处理显著抑制了主根伸长;与WT相比,pldα1 pldδ-1和pldα1 pldδ-2双突变体主根伸长受抑制的情况更加明显,其中,双突变体根分生区长度和细胞数目也显著减少;但外源添加PA显著缓解双突变体受抑制的情况。为了进一步研究PLD/PA对铵离子吸收的调控作用,我们用N标记的(NH)SO对WT和pldα1 pldδ进行短时间处理并检测幼苗体内(NH)SO含量。检测结果发现,与WT相比,拟南芥pldα1 pldδ-1幼苗体内(NH)SO的放射值显著升高,该结果与长时间铵处理检测的NH含量结果一致。上述实验表明,高铵胁迫下,PLDα1和PLDδ负调控植物对NH的吸收与转运。我们利用H标记的PC(磷脂酰胆碱)和专一性的酶反应缓冲液,测定了高铵胁迫对WT拟南芥幼苗中PLDα1和PLDδ蛋白活性的影响,同时,采用免疫印迹实验来检测高铵处理后PLD蛋白含量变化。实验结果表明,高铵处理显著诱导PLD活性的升高;在蛋白表达水平上,高铵胁迫处理对PLDα1蛋白表达无显著影响,而PLDδ蛋白表达量降低,表明高铵胁迫可能直接激活PLD,而不是通过诱导其蛋白表达来实现。另外,利用PA专一性分子探针(PABD)检测了高铵处理前后根细胞PA含量的变化。激光共聚焦荧光检测结果发现,50 m M NH处理12 h后,根细胞膜PA含量显著升高。上述结果表明,高铵胁迫下,PLD被激活产生PA,通过某种机制抑制植物根对铵离子的吸收与转运,从而调控植物的耐铵性。已有研究表明,在外界胁迫下,第二信使PA通过直接结合靶蛋白,调控其表达、定位、或活性,进而调节下游细胞信号转导和植物抗逆性。铵转运蛋白AMT家族在植物中负责NH胞外到胞内的转运,为了确定PA是否通过结合AMT调节植物感受与应答高铵胁迫,从拟南芥中克隆了AMT1;1-AMT1;5的CDS区域,并将其胞内编码区构建到带有GST标签的p GEX4T-1表达载体,在BL21大肠杆菌中表达蛋白并纯化。脂-蛋白结合实验结果发现,PA与AMT1;1结合能力最强,与AMT1;2、AMT1;3、AMT1;4较弱,与AMT1;5结合最弱。同时,利用蛋白点突变技术研究发现,AMT1;1第487位的精氨酸(Arg,R)是其与PA结合的关键位点。为了进一步验证该结合位点的准确性以及其功能,构建了野生型回补载体Pro :AMT1;1-GFP和点突变回补载体Pro :m AMT1;1-GFP,转基因到拟南芥AMT四突变体qko(amt1;1 amt1;2amt1;3 amt2;1),筛选到纯合体并进行50 m M甲基铵(Me A)处理。与已有研究结果一致,qko突变体表现为甲基铵不敏感表型。我们的研究发现,Pro :AMT1;1-GFP;qko回补材料与WT类似,耐高铵的能力显著减弱,而点突变回补材料Pro :m AMT1;1-GFP;qko的主根长度略短于qko,但显著长于WT和Pro :AMT1;1-GFP;qko幼苗。因此,我们推测,AMT1;1结合PA的第487位精氨酸可能是其转运铵离子的关键位点。PA如何结合该位点并调控植物吸收和转运铵离子及其相关分子机制,仍需进一步研究。总之,本研究发现了一条基于PLD/PA植物感受与应答高铵胁迫的信号通路。在高铵胁迫下,细胞内PLDα1和PLDδ蛋白被激活,产生信号分子PA,PA特异性结合AMT1;1并抑制其活性以减少胞内NH的吸收与转运,从而提高植物耐高铵能力。本研究初步明确了磷脂调控植物铵吸收和转运的关键靶标,为后期耐高铵作物的种质筛选及其分子遗传改良提供了理论基础和基因资源。