检索结果-南通市图书馆

作者：曹阳阳北京林业大学

学位级别：硕士

氮素作为植物必需的矿质营养元素之一,是合成蛋白质、核酸和一些辅助因子等含氮化合物的必需组分。铵离子是植物根系吸收的最为经济有效的一种氮素形式。植物细胞膜上铵转运蛋白(ammonium transporters,amts)是植物根系吸收和转运铵根... 详细信息

氮素作为植物必需的矿质营养元素之一,是合成蛋白质、核酸和一些辅助因子等含氮化合物的必需组分。铵离子是植物根系吸收的最为经济有效的一种氮素形式。植物细胞膜上铵转运蛋白(ammonium transporters,amts)是植物根系吸收和转运铵根离子的重要载体,其对体内铵根离子平衡的调节是细胞能正常进行各种生理活动的基础。拟南芥中amts家族共有6个成员,其中amt1;3仅在根部特异性表达,负责根部铵根离子的吸收和转运。近有研究表明,泛素化修饰不但调控蛋白的降解,还作为膜蛋白内化信号参与蛋白的胞吞、内涵体中蛋白分选等过程。然而泛素化修饰是否调控铵转运蛋白amt1;3的胞吞及囊泡转运机制尚不十分明确,特别是对其动力学特征变化规律的研究仍十分匮乏。本研究在克隆了拟南芥amt1;3基因的基础上,获得了泛素化位点发生突变的amt1;3-EGFP转基因拟南芥植株。运用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)、可变角度全内反射荧光显微镜(variable-angle total internal reflection fluorescence microscope,VA-TIRFM)以及荧光相关光谱(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)等活细胞显微技术结合生物化学及分子生物学技术,在高铵胁迫条件下对amt1;3-EGFP转基因拟南芥植株进行研究,主要对amt1;3蛋白在质膜上的分布、运动模式、动力学参数、胞吞程度以及囊泡转运途径展开了较为深入的探讨。得到的主要结果如下:***1;3铵转运蛋白的降解途径分析:(1)通过免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)实验富集amt1;3蛋白,发现amt1;3在植物体内存在一个本底水平的泛素化修饰。(2)对拟南芥中铵转运蛋白amt1;3的稳态变化水平进行分析,发现高铵胁迫下amt1;3会在胞质中发生降解。运用高铵胁迫及26S蛋白酶体抑制剂MG132共处理amt1;3-EGFP转基因拟南芥,发现amt1;3蛋白的降解受到抑制,表明泛素化修饰参与高铵胁迫下amt1;3蛋白的降解。***1;3-EGFP突变体的获得:根据拓扑学结构对amt1;3铵转运蛋白可能发生泛素化的赖氨酸位点进行预测,成功将其突变为精氨酸,获得amt1;3-EGFP泛素化位点突变体材料。3.泛素化修饰对amt1;3蛋白动力学参数的影响:amt1;3在质膜上存在布朗运动、定向运动、受限运动以及混合运动等四种运动模式,其中布朗运动占比例最高,且泛素化修饰对amt1;3在质膜上的运动模式无显著影响。高铵胁迫条件下,突变体植株amt1;3-EGFP中amt1;3蛋白的扩散系数显著降低,长距离扩散所占的比例显著降低,运动速率显著上升,表明在高铵胁迫下泛素化缺失影响amt1;3在细胞质膜上的运动状态。4.泛素化修饰影响amt1;3蛋白的胞吞:正常铵处理条件下amt1;3-EGFP以及amt1;3-EGFP突变体植株中amt1;3蛋白的胞吞无明显差异,而在高铵胁迫条件下amt1;3-EGFP突变体中amt1;3蛋白的胞吞受到极显著的抑制,表明泛素化修饰影响高铵胁迫条件下amt1;3蛋白的胞吞。5.泛素化修饰对铵转运蛋白amt1;3囊泡转运途径调控的研究:构建amt1;3-EGFP和amt1;3-EGFP分别与细胞内膜系统标记株系VHA-a1-m RFP、At SNX1-m RFP、m RFP-SYP22杂交的拟南芥材料。在高铵胁迫条件下,突变体植株中amt1;3蛋白主要聚集在早期内涵体(early endosome,EE)中,减少向晚期内涵体(late endosome,LE)的转运以及液泡中的降解,表明植物amt1;3蛋白在高铵胁迫条件下其胞内循环与降解平衡机制受到影响。综上所述,本论文应用了多种光学成像技术结合生化及分子生物学手段,以amt1;3-EGFP突变体拟南芥的根尖伸长区为研究对象,在高铵胁迫处理条件下对amt1;3蛋白的动力学特征、胞吞程度以及囊泡转运过程的变化进行了分析。研究发现:在高铵胁迫条件下,泛素化修饰参与amt1;3蛋白的降解;amt1;3在细胞质膜上的运动是高度动态的,泛素化修饰通过改变amt1;3蛋白在质膜上的动力学从而影响对外界铵的吸收与转运;高铵胁迫条件下,泛素化修饰的缺失抑制了amt1;3蛋白的胞吞,导致大部分的蛋白滞留在质膜上;通过对amt1;3蛋白在细胞内的转运过程进行研究,发现在高铵胁迫下泛素化修饰降低了amt1;3蛋白进入液泡中降解的比例,导致其囊泡循环与降解平衡机制受到影响。以上研究成果表明泛素化修饰引发高铵胁迫下铵转运蛋白amt1;3在细胞质膜上运动状态、胞吞程度以及囊泡转运

关键词： amt1 3 泛素化修饰动力学胞吞作用囊泡转运

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拟南芥磷脂酶D调控amt1;1和应答高铵胁迫的分子机理

拟南芥磷脂酶D调控AMT1;1和应答高铵胁迫的分子机理

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作者：刘晓南京农业大学

学位级别：硕士

氮是植物在生长发育过程中必不可少的大量元素之一,但作为植物两种氮源之一的铵对植物的毒害早在一个世纪前便有报道。由于人为、自然因素,地面土壤中的铵态氮浓度连年呈上升趋势,对农作物的产量和品质均产生不良影响。植物铵转运蛋白(A... 详细信息

氮是植物在生长发育过程中必不可少的大量元素之一,但作为植物两种氮源之一的铵对植物的毒害早在一个世纪前便有报道。由于人为、自然因素,地面土壤中的铵态氮浓度连年呈上升趋势,对农作物的产量和品质均产生不良影响。植物铵转运蛋白(Ammonium transporter,amt)是重要的吸收和转运铵盐的家族,对调节植物的生长、发育具有重要作用。amt1家族属于高亲和铵态氮转运蛋白,主要包括amt1;1、amt1;2、amt1;3、amt1;4和amt1;5。其中,在低铵环境下,amt1吸收与转运铵离子的分子机制研究已取得较大进展;但是,高铵胁迫下,amt1如何主动减少铵离子吸收及其相关的分子调控机制,尚不清楚;磷脂酶是否参与该过程,也尚无报道。本研究以模式植物拟南芥为实验材料,研究了PLD和PA调控amt1;1功能和应答高铵胁迫的分子机制。主要研究结果如下:首先,我们对拟南芥野生型(WT)和PLD双突变体(pldα1 pldδ-1和pldα1 pldδ-2)进行了50 m M高铵处理并统计其根伸长情况。研究结果表明,高铵处理显著抑制了主根伸长;与WT相比,pldα1 pldδ-1和pldα1 pldδ-2双突变体主根伸长受抑制的情况更加明显,其中,双突变体根分生区长度和细胞数目也显著减少;但外源添加PA显著缓解双突变体受抑制的情况。为了进一步研究PLD/PA对铵离子吸收的调控作用,我们用N标记的(NH)SO对WT和pldα1 pldδ进行短时间处理并检测幼苗体内(NH)SO含量。检测结果发现,与WT相比,拟南芥pldα1 pldδ-1幼苗体内(NH)SO的放射值显著升高,该结果与长时间铵处理检测的NH含量结果一致。上述实验表明,高铵胁迫下,PLDα1和PLDδ负调控植物对NH的吸收与转运。我们利用H标记的PC(磷脂酰胆碱)和专一性的酶反应缓冲液,测定了高铵胁迫对WT拟南芥幼苗中PLDα1和PLDδ蛋白活性的影响,同时,采用免疫印迹实验来检测高铵处理后PLD蛋白含量变化。实验结果表明,高铵处理显著诱导PLD活性的升高;在蛋白表达水平上,高铵胁迫处理对PLDα1蛋白表达无显著影响,而PLDδ蛋白表达量降低,表明高铵胁迫可能直接激活PLD,而不是通过诱导其蛋白表达来实现。另外,利用PA专一性分子探针(PABD)检测了高铵处理前后根细胞PA含量的变化。激光共聚焦荧光检测结果发现,50 m M NH处理12 h后,根细胞膜PA含量显著升高。上述结果表明,高铵胁迫下,PLD被激活产生PA,通过某种机制抑制植物根对铵离子的吸收与转运,从而调控植物的耐铵性。已有研究表明,在外界胁迫下,第二信使PA通过直接结合靶蛋白,调控其表达、定位、或活性,进而调节下游细胞信号转导和植物抗逆性。铵转运蛋白amt家族在植物中负责NH胞外到胞内的转运,为了确定PA是否通过结合amt调节植物感受与应答高铵胁迫,从拟南芥中克隆了amt1;1-amt1;5的CDS区域,并将其胞内编码区构建到带有GST标签的p GEX4T-1表达载体,在BL21大肠杆菌中表达蛋白并纯化。脂-蛋白结合实验结果发现,PA与amt1;1结合能力最强,与amt1;2、amt1;3、amt1;4较弱,与amt1;5结合最弱。同时,利用蛋白点突变技术研究发现,amt1;1第487位的精氨酸(Arg,R)是其与PA结合的关键位点。为了进一步验证该结合位点的准确性以及其功能,构建了野生型回补载体Pro :amt1;1-GFP和点突变回补载体Pro :m amt1;1-GFP,转基因到拟南芥amt四突变体qko(amt1;1 amt1;2amt1;3 amt2;1),筛选到纯合体并进行50 m M甲基铵(Me A)处理。与已有研究结果一致,qko突变体表现为甲基铵不敏感表型。我们的研究发现,Pro :amt1;1-GFP;qko回补材料与WT类似,耐高铵的能力显著减弱,而点突变回补材料Pro :m amt1;1-GFP;qko的主根长度略短于qko,但显著长于WT和Pro :amt1;1-GFP;qko幼苗。因此,我们推测,amt1;1结合PA的第487位精氨酸可能是其转运铵离子的关键位点。PA如何结合该位点并调控植物吸收和转运铵离子及其相关分子机制,仍需进一步研究。总之,本研究发现了一条基于PLD/PA植物感受与应答高铵胁迫的信号通路。在高铵胁迫下,细胞内PLDα1和PLDδ蛋白被激活,产生信号分子PA,PA特异性结合amt1;1并抑制其活性以减少胞内NH的吸收与转运,从而提高植物耐高铵能力。本研究初步明确了磷脂调控植物铵吸收和转运的关键靶标,为后期耐高铵作物的种质筛选及其分子遗传改良提供了理论基础和基因资源。

关键词：拟南芥高铵胁迫磷脂酶D 磷脂酸 amt1 1

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杜梨铵转运蛋白基因的克隆表达及在梨属植物中的SNP分析

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西北植物学报 2011年第10期31卷 1942-1950页

作者：丛郁杨顺瑛宋志忠郝东利苏彦华土壤与农业可持续发展国家重点实验室中国科学院南京土壤研究所南京210008

利用EST并结合RACE方法从杜梨幼苗克隆获得1个amt基因(Pbamt1;2).分析显示,Pbamt1;2cDNA全长1 811 bp,开放阅读框为1 515 bp,其对应基因组DNA序列不含内含子.Pbamt1;2编码的蛋白由504个氨基酸组成,具有11个跨膜域,1个N-糖基化位点、3个... 详细信息

利用EST并结合RACE方法从杜梨幼苗克隆获得1个amt基因(Pbamt1;2).分析显示,Pbamt1;2cDNA全长1 811 bp,开放阅读框为1 515 bp,其对应基因组DNA序列不含内含子.Pbamt1;2编码的蛋白由504个氨基酸组成,具有11个跨膜域,1个N-糖基化位点、3个酪蛋白激酶磷酸化位点和8个蛋白激酶C磷酸化位点.同源性分析发现,Pbamt1;2与其他植物的amt具有较高的一致性,其中与百脉根Ljamt1;2的一致性为80.23%,与拟南芥Atamt1;2的一致性为78.68%,与番茄Leamt1;2的一致性为77.80%.系统进化树分析表明,Pbamt1;2属于amt1亚家族.半定量RT-PCR结果显示,Pbamt1;2主要在根部表达,而在茎和叶中几乎没有表达.以杜梨、豆梨、砂梨、白梨、秋子梨和西洋梨等6种梨属植物的DNA为模板,高保真Taq酶PCR扩增amt1;2基因ORF区DNA序列,发现6种梨属植物的amt1;2 ORF区DNA序列长度均为1 515 bp,相似性高达99.48%,但在44个核苷酸位点中存在SNPs,导致18个氨基酸位点发生变异,多态性频率为1SNP/34.43 bp,核苷酸变异度为2.9%,氨基酸变异度为3.57%.

关键词：杜梨 amt1 2基因克隆梨属植物单核苷酸多态性

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基于转录组测序的小麦抗秆锈病机制初步探究

基于转录组测序的小麦抗秆锈病机制初步探究

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作者：廖凯沈阳农业大学

学位级别：硕士

小麦秆锈菌(Puccicinia graminis ***)夏孢子侵染小麦,其致病导致的小麦秆锈病是一种能伴随高空气流传播的跨洲际农业生产病害。目前对于小麦秆锈菌侵染小麦的机制尚不清楚,小麦对于小麦秆锈菌的免疫防御机制也很少被报道。小密穗(Littl... 详细信息

小麦秆锈菌(Puccicinia graminis ***)夏孢子侵染小麦,其致病导致的小麦秆锈病是一种能伴随高空气流传播的跨洲际农业生产病害。目前对于小麦秆锈菌侵染小麦的机制尚不清楚,小麦对于小麦秆锈菌的免疫防御机制也很少被报道。小密穗(Little Club,LC)是Stak man经反复筛选,确定的12个标准鉴别寄主之一。LC虽然不是主栽品种,但是LC是万能高感小麦品种,被认为不含对小麦秆锈菌的抗病基因。因此,LC十分适合研究小麦秆锈菌侵染小麦的组织学和分子机制上的研究。小麦秆锈菌侵染小麦3天吸器形成,完成侵染阶段;侵染小麦6天完成产孢,秆锈病发病阶段开始。因此,我们选取中国高毒力频率小种小麦秆锈菌菌株34MKGQM接种LC 3天和6天的样品进行转录组测序研究,得到结果如下:1.转录组测序发现了114429个显著差异性基因,其中GO功能分析,LC接菌3天后,共有24类功能基因被激活;LC接菌6天后,共有26类功能基因被激活,两者GO功能分析都检测出:包含植物激素信号、转运功能、细胞组成和生物合成等功能基因。2.代谢通路分析:LC接菌3天后共30条代谢途径被激活,6天后35条代谢途径被激活。这两组包括激素代谢途径、氮素代谢途径。其中激素信号通路中有5种激素显著上调(log>log,logamt蛋白与水稻amt蛋白同源性最高,暗示小麦amt在小麦中也能发挥运输NH能力。qRT-PCR检测显示,小麦根、茎秆、叶和花组织中,Taamt1;1a,Taamt1;1b,Taamt1;3a表达量最为丰富,而其他Taamt基因表达量很少。明尼2761和LC接菌后,qRT-PCR检测发现在侵染小麦0-48h时间内,LC体内Taamt1;1a,Taamt1;1b和Taamt1;3a的表达量显著上调,明尼2761体内Taamt1;1a、Taamt1;1b、Taamt1;3a的表达量无明显变化。含氮和无氮试验显示,无氮条件下小麦秆锈菌对LC侵染型显著降低,由“4”型到“3”型。这些研究说明小麦amt1可能参与负调控小麦抗秆锈病作用。

关键词：小麦秆锈菌转录组 LC 明尼2761 amt1

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