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猪带绦虫TS045W-4B—TSOL18融合基因在大肠埃希菌ArcticExpress（DE3）中的表达、纯化和兔抗血清的制备

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中华地方病学杂志 2013年第6期32卷 619-624页

作者：周泠周必英刘美辰刘晖贺莉芳遵义医学院寄生虫学教研室 563003 遵义医学院附属第一医院中医科 563003

目的构建猪带绦虫pGEX—TS045W-4B-TSOL18重组质粒，纯化重组融合蛋白及制备兔抗重组蛋白血清。方法用疏水甘氨酸接头（Gly,Ser），连接TS045W-4B和TSOL18编码基因，通过全基因合成猪带绦虫TS045W-4B—TSOL18融合基因。将融合基因定向... 详细信息

目的构建猪带绦虫pGEX—TS045W-4B-TSOL18重组质粒，纯化重组融合蛋白及制备兔抗重组蛋白血清。方法用疏水甘氨酸接头（Gly,Ser），连接TS045W-4B和TSOL18编码基因，通过全基因合成猪带绦虫TS045W-4B—TSOL18融合基因。将融合基因定向克隆到pGEX—1λT表达载体上，构建重组质粒pGEX—TS045W-4B—TSOL18，再用重组质粒转化大肠埃希菌（***）ArcticExpress（DE3）。用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导其表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析表达情况，亲和层析纯化获得重组融合蛋白。用纯化的重组蛋白按0．5mg／只与弗氏完全佐剂（CFA）混合，于兔后腿肌肉及背部皮下多点免疫注射；2周后再用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂（IFA）混合加强免疫，此后每隔10d按第2次免疫法重复加强免疫，第4次免疫后6d，采集兔心脏血并分离血清，立即纯化及制备抗血清。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定抗血清的效价，采用蛋白印迹（Western blot）法鉴定抗血清的特异性。结果全基因合成的TS045W-4B—TSOL18融合基因片段长度为789bp。酶切证实pGEX—TS045W-4B—TSOL18重组质粒成功构建，测序结果获得的基因片段大小为789bp，与预期大小相符。SDS—PAGE分析和亲和层析后显示，重组质粒在转化*** ArcticExpress（DE3）后，获得了相对分子质量约为55×10。的重组融合蛋白，纯度为85％。EUSA测定兔抗血清的效价为1：512000，Westernblot证实抗血清能与重组融合蛋白发生特异性反应，在相对分子质量约为55×10^3处出现1条与预期大小-致的特异性条带。结论成功地构建猪带绦虫重组质粒pGEX—TS045W-4B—TSOL18及制备了高纯度的TS045W-4B—TSOL18重组融合蛋白和高滴度的兔抗重组蛋白血清。

关键词：猪带绦虫 TS045W-4B—TSOL18编码基因重组融合蛋白抗血清

猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂B6基因的鉴定、表达及抗原性分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2016年第4期34卷 334-338,345页

作者：刘光学张少华郭爱疆侯俊玲魏艳玲王帅骆学农中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

目的鉴定、表达猪带绦虫(Taenia solium)丝氨酸蛋白酶抑制剂(Tsserpin B6),探索其作为诊断抗原的可行性。方法利用猪带绦虫基因组和转录组数据设计Tsserpin B6特异引物,RT-PCR扩增获得Tsserpin B6基因,对其DNA、氨基酸序列进行生物信息... 详细信息

目的鉴定、表达猪带绦虫(Taenia solium)丝氨酸蛋白酶抑制剂(Tsserpin B6),探索其作为诊断抗原的可行性。方法利用猪带绦虫基因组和转录组数据设计Tsserpin B6特异引物,RT-PCR扩增获得Tsserpin B6基因,对其DNA、氨基酸序列进行生物信息学分析,利用Clustal X1.83进行序列比对,并用MEGA6.0进行系统进化分析。构建pET-30a-Tsserpin B6重组表达载体,在大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达。纯化表达的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),用猪囊尾蚴阳性血清进行蛋白质印迹(Western blotting)鉴定。结果Tsserpin B6开放阅读框为1 131 bp,编码376个氨基酸。其编码的氨基酸序列具有serpin较为保守的反应中心环和特征性结构域(NEEGAE和FTVDHPFLF),存在9个潜在的线性B淋巴细胞抗原表位。Tsserpin B6的表达产物相对分子质量(M_r)为53 000,主要以包涵体形式存在。Western blotting检测结果显示,所表达的蛋白可与猪囊尾蚴阳性血清发生特异性反应,在M_r 53 000处产生特异条带。结论克隆了Tsserpin B6基因,其表达产物能被猪囊尾蚴阳性血清所识别。

关键词：猪带绦虫 Tsserpin B6 鉴定表达抗原性分析

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猪带绦虫六钩蚴超微结构的观察

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2009年第1期27卷 35-38页

作者：孙晓林才学鹏景志忠米晓云王佩雅陈怀涛甘肃农业大学动物医学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046 新疆畜牧科学院兽医研究所乌鲁木齐830000

目的观察猪带绦虫六钩蚴的超微结构。方法猪带绦虫病患者驱虫,收集成熟虫卵。次氯酸钠法破卵壳后,等渗细胞分离液(Percoll)收集六钩蚴,人工肠液激活。热琼脂离心法制备电镜样品,透射电镜观察。结果猪带绦虫成熟六钩蚴呈卵圆形,(14～17)... 详细信息

目的观察猪带绦虫六钩蚴的超微结构。方法猪带绦虫病患者驱虫,收集成熟虫卵。次氯酸钠法破卵壳后,等渗细胞分离液(Percoll)收集六钩蚴,人工肠液激活。热琼脂离心法制备电镜样品,透射电镜观察。结果猪带绦虫成熟六钩蚴呈卵圆形,(14～17)μm×(10～13)μm,表面有不规则的突起或皱褶。六钩蚴小钩从外至内由颗粒带、纤维层和芯髓组成。成熟六钩蚴具成肌细胞、小钩生发细胞和皮层细胞等几种细胞类型。结论猪带绦虫六钩蚴的超微结构和缩小膜壳绦虫(Hymenolepis diminuta)六钩蚴的超微结构相似,但小钩的结构不同;猪带绦虫六钩蚴有形成上皮的双核细胞。

关键词：猪带绦虫六钩蚴超微结构透射电镜

猪带绦虫六钩蚴表膜结合蛋白45WB_2基因在毕赤酵母中的表达

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2005年第3期23卷 171-174页

作者：王谨骆学农岳城胡志敏才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点实验室兰州730046 新疆农业大学化工学院乌鲁木齐830052

目的从猪带绦虫六钩蚴总RNA中扩增45WB2基因,并在甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K中获得高效表达。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从孵化激活的六钩蚴克隆获得459bp的基因,亚克隆至酵母分泌表达载体pPIC9K中,经测序验证读码框正确后... 详细信息

目的从猪带绦虫六钩蚴总RNA中扩增45WB2基因,并在甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K中获得高效表达。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从孵化激活的六钩蚴克隆获得459bp的基因,亚克隆至酵母分泌表达载体pPIC9K中,经测序验证读码框正确后,重组质粒电转化毕赤酵母SMD1168菌株。用PCR方法检测结果表明,目的基因整合进毕赤酵母染色体DNA中。重组菌株用1%甲醇诱导,分别取诱导72和96h的上清和沉淀进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Westernblotting)分析。结果重组菌株在毕赤酵母中的表达蛋白分子量为Mr16000,表达产物占上清总蛋白量的32.8%,且能被猪囊尾蚴病患者血清识别。结论基因在毕赤酵母中成功表达,表达产物有望作为免疫原用于猪囊尾蚴病的免疫预防。

关键词：猪带绦虫六钩蚴表膜结合蛋白基因毕赤酵母菌基因表达

猪带绦虫重组双歧杆菌（pGEX-TSO45W-4B）疫苗构建及鉴定

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中华地方病学杂志 2014年第6期33卷 591-595页

作者：周必英刘美辰贺莉芳遵义医学院寄生虫学教研室 563003

目的构建和鉴定猪带绦虫重组双歧杆菌（Bb）（pGEX-TSO45W-4B）疫苗.方法通过全基因合成猪带绦虫TSO45W-4B基因,预期该基因中的片段长度为351 bp.将该基因定向克隆到大肠埃希菌-Bb穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B... 详细信息

目的构建和鉴定猪带绦虫重组双歧杆菌（Bb）（pGEX-TSO45W-4B）疫苗.方法通过全基因合成猪带绦虫TSO45W-4B基因,预期该基因中的片段长度为351 bp.将该基因定向克隆到大肠埃希菌-Bb穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B,电穿孔法将该质粒导入长双歧杆菌,构建猪带绦虫重组Bb（pGEX-TSO45W-4B）疫苗,通过酶切、PCR和测序进行鉴定,证实猪带绦虫重组Bb （pGEX-TSO45W-4B）疫苗中含有片段长度为351 bp的基因.结果全基因合成351 bp的TSO45W-4B基因片段.酶切、PCR和测序鉴定证明猪带绦虫重组Bb （pGEX-TSO45W-4B）疫苗构建成功,均获得了351 bp基因片段.结论成功构建了猪带绦虫重组Bb （pGEX-TSO45W-4B）疫苗,为该疫苗的表达及免疫原性研究奠定了基础.

关键词：猪带绦虫重组Bb (pGEX-TSO45W-4B)疫苗构建鉴定

猪带绦虫囊尾蚴与亚洲带绦虫囊尾蚴蛋白双向电泳图谱分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2011年第3期29卷 188-190页

作者：方文肖靓靓包怀恩牟荣贵阳医学院医学检验系贵阳550004 贵阳医学院寄生虫学教研室贵阳550004

将2头20日龄三元杂交乳猪分别感染猪带绦虫虫卵和亚洲带绦虫虫卵,8×104个/头。感染后40 d分别收集寄生在肝脏的未成熟猪带绦虫囊尾蚴(简称猪囊尾蚴)和亚洲带绦虫囊尾蚴,制备囊尾蚴蛋白,并进行蛋白双向电泳分析,用ImageMaster 2D Planti... 详细信息

将2头20日龄三元杂交乳猪分别感染猪带绦虫虫卵和亚洲带绦虫虫卵,8×104个/头。感染后40 d分别收集寄生在肝脏的未成熟猪带绦虫囊尾蚴(简称猪囊尾蚴)和亚洲带绦虫囊尾蚴,制备囊尾蚴蛋白,并进行蛋白双向电泳分析,用ImageMaster 2D Plantinum 6.0软件分析差异表达蛋白。结果显示,感染后40 d肝脏寄生的未成熟猪囊尾蚴和亚洲带绦虫囊尾蚴蛋白的双向电泳凝胶上分别有(236±12)和(231±14)个蛋白斑点,差异表达2倍以上的蛋白共10个,其中猪囊尾蚴表达上调的蛋白3个,下调的蛋白7个。

关键词：猪带绦虫亚洲带绦虫囊尾蚴双向电泳蛋白质组

猪带绦虫双歧杆菌表达系统pGEX-TSOL18/***的构建及鉴定

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2014年第3期32卷 239-241页

作者：周必英刘美辰贺莉芳遵义医学院寄生虫学教研室遵义563003

通过全基因合成猪带绦虫TSOL18基因,将该基因定向克隆至大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-TSOL18,电穿孔法将该质粒导入长双歧杆菌(Bifidobacterium longum),构建猪带绦虫双歧杆菌表达系统pGEX-TSOL18/***... 详细信息

通过全基因合成猪带绦虫TSOL18基因,将该基因定向克隆至大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-TSOL18,电穿孔法将该质粒导入长双歧杆菌(Bifidobacterium longum),构建猪带绦虫双歧杆菌表达系统pGEX-TSOL18/***,并通过酶切、PCR和测序鉴定。全基因合成了393 bp的TSOL18基因片段。酶切、PCR和测序鉴定结果证明猪带绦虫双歧杆菌表达系统pGEX-TSOL18/***构建成功。

关键词：猪带绦虫双歧杆菌 TSOL18 重组菌

猪带绦虫重组Bb—TS045W-4B—TSOL18疫苗诱导仔猪的保护性免疫应答

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中华地方病学杂志 2015年第10期34卷 717-722页

作者：贾启刘美辰周泠杨凤娇江楠王灵军周必英遵义医学院寄生虫学教研室 563000 遵义医学院附属医院中医肛肠科

目的探讨猪带绦虫重组***18疫苗免疫仔猪后，对猪带绦虫卵攻击感染后的保护性免疫应答。方法将20头40日龄健康仔猪按体质量（约15kg）采用随机数字表法分为5组，每组4头。分别为重组b-TS045W．4B—TSOL18疫苗灌胃组、重组Bb—TS045W-4B... 详细信息

目的探讨猪带绦虫重组***18疫苗免疫仔猪后，对猪带绦虫卵攻击感染后的保护性免疫应答。方法将20头40日龄健康仔猪按体质量（约15kg）采用随机数字表法分为5组，每组4头。分别为重组b-TS045W．4B—TSOL18疫苗灌胃组、重组Bb—TS045W-4B疫苗灌胃组、重组Bb-TSOLl8疫苗灌胃组、空载体对照组和双歧杆菌液体培养基（MRS）对照组。各疫苗的免疫剂量为1×10“菌落形成单位（CFU），间隔2周免疫1次，共免疫2次。于末次免疫仔猪4周后，各组仔猪用猪带绦虫卵攻击感染，攻击感染后3个月剖杀仔猪，分离猪囊尾蚴，计算减蚴率；前腔静脉取血，分离血清和制备外周血淋巴细胞（PBMC）。酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测血清免疫球蛋白（Ig）G、IgGl、lgG2a水平和PBMC培养上清液中白细胞介素（IL）．2、干扰素（IFN）．1、IL4及IL-10水平；四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测PBMC增殖情况。结果猪带绦虫重组***8、重组Bb—TS045W．4B、重组Bb—TSOLl8疫苗灌胃组减蚴率分别为83．09％、71.36％和74．85％。仔猪血清IgG、IgGl和IgG2a水平组间比较差异均有统计学意义（F=132．348、106．336、596．091，P〈0．05）。其中重组Bb-TS045W-4B-TSOL18、重组Bb-TS045W-4B、重组***18疫苗灌胃组IgG、IgG2a水平[（366．81±3．84）、（334．94±11．65）、（333．52±11．09），（87．74±0．95）、（84．48±0．80）、（84．30±1．09）mg／L]均高于MRS对照组[（245．94±8．81）、（62．61±0．84）mg／L，P均〈0．05]，IgGl水平[（26．55±1．06）、（33．24±1．92）、（32．60±1．94）mg／L]低于MRS对照组[（42．78±0．87）mg／L，P均〈0．05]。仔猪PBMC培养上清原液中IL-2、IFN-1、IL．4和IL．10水平组间比较差异均有统计学意义（F=139．522、1053．102、769．097、962．298，P均〈0．05）。其中重组***8、重组Bb-TS045W．4B、重组Bb—TSOLl8疫苗灌胃组IL-2、IFN．1水平[（212．24±3．12）、（205．91±3．18）、（205．85±4．35），（28．42±0．28）、（25．56±0．28）、（25．71±0．35）ng／L]均高于MRS对照组[（174．19±2．14）、（17．69±0．28）ng／L，P均〈0．05]，IL-4、IL．10水平[（40．45±036）、（41．38±0．70）、（41．52±0．19），（71．45±0．83）、（73．38±0．70）、（74．77±0．41）ng／L]均低于MRS对照组[（52．57±0．29）、（94．82±0．45）ng／L，P均〈0．05]。仔猪PBMC增殖水平组间比较差异有统计学意义（F=56．318，P〈0．05）。其中重组***8、重组Bb—TS045W．4B、重组***18疫苗灌胃组PBMC增殖水平（0．543±0．074、0．481±0．028、0．530±0．053）均高于MRS对照组（0．242±0．053，P均〈0．05）。结论猪带绦虫重组Bb—***8疫苗能够诱导仔猪产生一定的保护力，其中Thl型免疫应答在其诱导的保护性免疫机制中起重要作用。

关键词：猪带绦虫重组Bb-TSO45W-4B-TSOL18疫苗保护性免疫应答仔猪

猪带绦虫TSO45W-4B基因的克隆、表达和抗体制备

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2013年第5期31卷 372-375页

作者：周必英周泠刘美辰刘晖张曦遵义医学院寄生虫学教研室遵义医学院附属第一医院中医科遵义563003

目的克隆、表达猪带绦虫TSO45W-4B基因,以重组蛋白TSO45W-4B免疫兔制备抗体。方法全基因合成猪带绦虫TSO45W-4B抗原编码基因,定向克隆至pGEX-1λT表达载体,构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B。转化至大肠埃希菌ArcticExpress(DE3)后,异丙基-β... 详细信息

目的克隆、表达猪带绦虫TSO45W-4B基因,以重组蛋白TSO45W-4B免疫兔制备抗体。方法全基因合成猪带绦虫TSO45W-4B抗原编码基因,定向克隆至pGEX-1λT表达载体,构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B。转化至大肠埃希菌ArcticExpress(DE3)后,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达情况。表达产物经谷胱甘肽-S-转移酶(GST)亲和层析柱纯化后,免疫新西兰大白兔,制备抗血清。GST亲和层析柱纯化获得血清中抗体后,ELISA测定抗体效价,蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定抗体特异性。结果酶切和测序结果表明,重组质粒pGEX-TSO45W-4B构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白相对分子质量(M r)约为40 000,经GST亲和层析后可获得纯度为90%以上的重组蛋白。ELISA结果显示,抗体的效价为1∶512 000。Western blotting分析结果显示,该抗体能与纯化的重组蛋白发生特异性反应,在约M r40 000处出现一条带,与预期大小一致。结论猪带绦虫TSO45W-4B基因能在大肠埃希菌中表达,制备了TSO45W-4B重组蛋白和兔抗血清。

关键词：猪带绦虫 TSO45W-4B 表达纯化抗体