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人脐带沃顿胶薄片对大鼠面神经损伤后髓鞘的修复作用

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郑州大学学报（医学版） 2019年第3期54卷 367-372页

作者：李牧李东朋宋迪赵成斌岳赛超冯杰杨波关方霞郑州大学第一附属医院神经外科郑州450052 北京回龙观医院精神科北京102200

目的:观察人脐带沃顿胶薄片对大鼠面神经损伤后髓鞘的修复效果及可能机制。方法:64只成年雌性Wistar大鼠随机分成假手术组(n=14)、模型组(n=25)及沃顿胶薄片组(n=25),后2组建立面神经挤压伤模型,其中,沃顿胶薄片组将人脐带沃顿胶薄片贴... 详细信息

目的:观察人脐带沃顿胶薄片对大鼠面神经损伤后髓鞘的修复效果及可能机制。方法:64只成年雌性Wistar大鼠随机分成假手术组(n=14)、模型组(n=25)及沃顿胶薄片组(n=25),后2组建立面神经挤压伤模型,其中,沃顿胶薄片组将人脐带沃顿胶薄片贴附于面神经挤压伤处。分别于造模后第1、3、10、20、30天评价面神经功能。造模后第30天测定面神经电生理。取损伤处面神经主干,采用HE染色观察病理改变,透射电镜观察超微结构; Western blot检测髓鞘碱性蛋白(MBP)、脑源性神经营养因子(BDNF)及神经生长因子(NGF)的表达; ELISA测定炎症因子IL-1β、IL-10、TNF-α、NF-κB的分泌。结果:造模后第1、3、10、20、30天,模型组面神经功能评分均较假手术组升高;第20、30天,沃顿胶薄片组面神经功能评分较模型组降低(P 沃顿胶薄片组以上2指标均较模型组改善(P 沃顿胶薄片组面神经组织结构恢复,可见再生的髓鞘;透射电镜下可见模型组神经纤维肿胀,呈现脱髓鞘改变,而沃顿胶薄片组髓鞘明显增厚,髓鞘板层结构松散明显好转,空泡状改变减少。与模型组相比,沃顿胶薄片组MBP、BDNF及NGF的表达增多,IL-1β、IL-10、NF-κB的表达降低(P 沃顿胶薄片可促进大鼠面神经损伤后的髓鞘修复,其机制可能与沃顿胶中MBP促进神经营养因子的分泌,减少炎症因子的释放,从而改善损伤区域局部微环境有关。

关键词：人脐带沃顿胶面神经损伤神经修复电生理髓鞘

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探索脐带沃顿胶作为软骨组织工程复合体前体的可行性初步研究

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探索脐带沃顿胶作为软骨组织工程复合体前体的可行性初步研究

作者：刘岸松中南大学

学位级别：硕士

目的：本课题通过了解脐带沃顿胶的组织形态和成分,分析沃顿胶是否可能作为一种新型的软骨组织工程复合体前体。方法：取足月健康新生儿新鲜脐带：1、结构研究将脐带分别做横行、纵行组织切片后,分别行HE染色并观察沃顿胶的微观形态、... 详细信息

目的：本课题通过了解脐带沃顿胶的组织形态和成分,分析沃顿胶是否可能作为一种新型的软骨组织工程复合体前体。方法：取足月健康新生儿新鲜脐带：1、结构研究将脐带分别做横行、纵行组织切片后,分别行HE染色并观察沃顿胶的微观形态、结构。另取脐带切成大小约5×1×1mm3的小块固定后,利用扫描电镜观察脐带沃顿胶表观形态结构;2、成分研究取新鲜脐带制备组织切片,通过PAS染色、Masson染色和免疫组化染色对切片分别染色并检测,观察染色后沃顿胶被染色的情况。另取新鲜脐带,去除脐带外膜及脐带动静脉,获得沃顿胶,经物理和化学消化的方法获得细胞混悬液,使用细胞计数仪对混悬液中的细胞进行计数,然后用CD29、 CD90、CD45三种细胞表面抗原标记混悬细胞液中的脐带间充质干细胞,使用流式细胞仪检测混悬液中满足CD29(+).CD90(+)、CD45(-)三个条件的细胞在所有细胞中所占的百分比,计算出脐带间充质干细胞在总的细胞中所占的百分比。结果：1、沃顿胶结构通过HE染色及电镜,发现脐带沃顿胶胶原纤维是以脐血管走向为中心的,靠近血管以纵行为主,靠近外膜以环形为主的编制状结构,由外膜至内侧血管,纤维结构由稀疏逐渐变得密集。沃顿胶纤维结构之间存在空隙。2、沃顿胶成分沃顿胶主要成分含有胶原纤维、糖胺多糖及细胞,胶原成分中含Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三种胶原,脐带沃顿胶中所含有的细胞数目为(2.04±0.59)×106cell/g。沃顿胶中脐带间充质干细胞在所有的细胞中所占的比例为(54.67±19.02)%。结论：脐带沃顿胶的结构和成分与软骨相似且初步满足软骨组织工程的要求,是可能的软骨组织工程复合体前体。

关键词：沃顿胶软骨组织工程复合体结构成分

炎性微环境下锌离子沃顿胶支架调节巨噬细胞促进大鼠软骨再生分化的研究

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炎性微环境下锌离子沃顿胶支架调节巨噬细胞促进大鼠软骨再生分化...

作者：毕懿康山东第一医科大学

学位级别：硕士

背景免疫细胞释放的炎性因子被认为是影响软骨再生及修复的重要因素。而很多伴随软骨损伤的疾病如骨性关节炎等都伴随着炎症反应,这使得原本就缺乏血管、神经的软骨组织处在一个炎性微环境中,修复变得更加困难。以往软骨组织工程支架重... 详细信息

背景免疫细胞释放的炎性因子被认为是影响软骨再生及修复的重要因素。而很多伴随软骨损伤的疾病如骨性关节炎等都伴随着炎症反应,这使得原本就缺乏血管、神经的软骨组织处在一个炎性微环境中,修复变得更加困难。以往软骨组织工程支架重点关注性状、力学性能、组织相容性等,而忽略了抗炎性能。作为是生命代谢中重要的微量金属元素,锌元素是多种生物酶类的重要辅基,具有明确的抗炎抗氧化及抗菌作用。目的本研究以脐带中的沃顿胶为原料,通过负载锌离子,构建具有抗炎性能的锌离子支架。探索锌离子支架浸提液对在炎性微环境下对巨噬细胞极化和巨噬细胞诱导炎症反应的调节作用,并进一步阐明这些调节作用对软骨再生的影响。方法本实验分为三部分。第一部分锌离子沃顿胶支架的制备及性能检测从脐带中分离的沃顿胶(Wharton’s Jelly,WJ),通过机械粉碎、低渗法、酶消化法、反复冻融及差速离心技术脱细胞,冷冻干燥机成型,制备出单纯沃顿胶支架(Wharton Jelly Scaffold,WJS)。将单纯沃顿胶支架通过模拟体液诱导沉积法负载0.01M(Zn1)和0.1M(Zn2)两个不同浓度的醋酸锌构建新型的锌离子沃顿胶支架(Zinc-Wharton’s Jelly Scaffold,Zn-WJS)。通过电子扫描电镜观察支架材料的表面结构,X射线光电子能谱仪表征支架表面元素组成与化学状态。采用电感耦合等离子体质谱检测锌离子支架的锌离子释放特征,根据释放曲线选择合适释放浓度的锌离子支架做后续实验。按标准方法用DMEM培养基制作沃顿胶支架的浸提液。用CCK8试剂盒检测支架浸提液细胞毒性,用鬼笔环肽染色观察细胞在支架上的黏附。第二部分锌离子支架浸提液对于巨噬细胞极化和巨噬细胞诱导炎症反应的调节作用在有或无脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活下,本部分实验分成六组,即常规DMEM完全培养基培养巨噬细胞作为空白组(Blank组),WJS浸提液完全培养基培养巨噬细胞组(WJS组),Zn-WJS浸提液完全培养基培养巨噬细胞组(Zn-WJS组),LPS诱导组(LPS组),LPS加入WJS浸提液完全培养基培养巨噬细胞组(LPS+WJS组)及LPS加入Zn-WJS浸提液完全培养基培养巨噬细胞组(LPS+Zn-WJS组)。培养3天后,用流式细胞仪和免疫荧光双染检测巨噬细胞表面标志物CCR7(代表M1表型)和CD206(代表M2表型)的表达。通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELLISA)试剂盒检测沃顿胶浸提液培养巨噬细胞的上清液中炎性因子白介素4(IL-4),白介素6(IL-6),肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白介素10(IL-10)释放情况。第三部分锌离子支架体外成软骨作用评价为了检测炎性微环境下锌离子支架的调节软骨再生的性能,先配制活化巨噬细胞的条件成软骨培养基(条件培养基)。此部分实验分为四组:沃顿胶支架负载大鼠骨髓间充质干细胞(rat Bone Marrow mesenchymal Stem Cells,rBMSCs)+普通成软骨培养基组(WJS),锌离子支架负载rBMSCs+条件培养基组(Zn-WJS),沃顿胶支架负载rBMSCs+条件成软骨培养基组(Conditioned+WJS),锌离子支架负载rBMSCs+条件培养基组(Conditioned+Zn-WJS),成软骨诱导21天后,通过HE染色、甲苯胺蓝染色、对软骨小球进行组织学评估,通过GAG测定评估各组软骨小球GAG含量,通过采用实时荧光定量PCR检测成软骨相关标志物Collagen type II,SOX9及Aggrecan的mRNA表达.结果第一部分锌离子沃顿胶支架的制备及性能检测电子扫描电镜下沃顿胶支架负载锌离子前后都呈三维立体取向多孔结构,符合组织工程支架以及本次实验的要求。X射线光电子能谱仪显示单纯的沃顿胶支架基本不含有锌元素,而负载锌离子后显示有锌离子负载。电感耦合等离子体质谱检测锌离子支架的锌离子释放在1-4天快速释放,7天后进入平台期,平台期锌离子浓度分别为Zn1≈1.01mg/L(15u M),Zn2≈7.26 mg/L(111u M),后续实验均选择Zn1浓度的锌离子沃顿胶支架。用CCK8试剂盒检测显示用Zn1和Zn2两种支架浸提液培养细胞在1,3,5天均未表现出明显的细胞毒性(P>0.05)。用鬼笔环肽染色显示细胞在支架上的黏附良好。第二部分锌离子支架浸提液对于巨噬细胞极化和巨噬细胞诱导炎症反应的调节作用免疫荧光及流式细胞检测显示,在无LPS存在的情况下,锌离子支架浸提液无明显诱导巨噬细胞极化的作用,在LPS活化巨噬细胞的环境下,锌离子支架浸提液能诱导巨噬细胞极化为抗炎表型(M2)(P<0.05),并抑制巨噬细胞向M1型分化(P<0.0

关键词：沃顿胶锌离子组织工程巨噬细胞极化软骨修复

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新型沃顿胶脱细胞软骨支架抑血管效应的研究

新型沃顿胶脱细胞软骨支架抑血管效应的研究

作者：齐军中南大学

学位级别：硕士

目的:基于脐带沃顿胶制备新型脱细胞软骨支架,研究化学冻融法和消化冻融法沃顿胶脱细胞支架在体外和体内抑血管生成的效应。方法:(1)使用化学冻融法和消化冻融法制备沃顿胶脱细胞支架,以目前软骨组织工程中广泛应用的10%GelMA水凝胶支... 详细信息

目的:基于脐带沃顿胶制备新型脱细胞软骨支架,研究化学冻融法和消化冻融法沃顿胶脱细胞支架在体外和体内抑血管生成的效应。方法:(1)使用化学冻融法和消化冻融法制备沃顿胶脱细胞支架,以目前软骨组织工程中广泛应用的10%GelMA水凝胶支架作为对照,制作化学冻融法和消化冻融法沃顿胶脱细胞支架、10%GelMA水凝胶支架并观察大体形态,HE染色观察支架微结构,测定支架的密度、孔隙率、溶胀率、降解率等理化性质。(2)配制各组支架浸提液,通过细胞死活染色、CCK-8检测各组支架的生物相容性;各组支架复合HUVECs共培养,通过VEGF免疫荧光染色、CCK-8检测支架促HUVECs增殖的能力;通过Scratch实验、Transwell迁移实验检测各组支架浸提液促HUVECs迁移的能力;通过Matrigel小管形成实验检测各组支架浸提液促HUVECs成管化的能力;RT-q PCR检测各组支架复合HUVECs体外培养3d、7d的成血管相关基因表达情况;ELISA检测各组支架复合HUVECs体外培养3d时的VEGF蛋白表达情况。(3)制备三组支架埋入裸鼠皮下,1周、2周、3周后取材行VEGF免疫荧光染色,并通过RT-q PCR检测各组皮下包埋支架的成血管相关基因的表达情况。结果:(1)化学冻融法和消化冻融法制备的沃顿胶脱细胞支架大体观呈现奶酪色、疏松多孔状,有一定的韧性,10%GelMA水凝胶支架呈现透明胶冻状,有较强的粘性和一定的弹性;密度:10%GelMA水凝胶支架>化学冻融法沃顿胶脱细胞支架>消化冻融法沃顿胶脱细胞支架;孔隙率:消化冻融法沃顿胶脱细胞支架>化学冻融法沃顿胶脱细胞支架>10%GelMA水凝胶支架;三组支架的溶胀率无统计学差异;降解率:化学/消化冻融法沃顿胶脱细胞支架>10%GelMA水凝胶支架。(2)细胞死活染色显示各组支架浸提液培养的HUVECs均生长良好,无明显死细胞,细胞密度:10%GelMA水凝胶支架组>对照组>化学/消化冻融法沃顿胶支架组。CCK-8检测各组浸提液培养HUVECs存活率均大于75%,各组支架生物相容性良好。各组支架复合HUVECs共培养3d、7d,VEGF免疫荧光染色显示化学和消化冻融法沃顿胶脱细胞支架的阳性面积显著小于10%GelMA水凝胶支架(P胶组(P0.05);24h时,化学冻融法组和消化冻融法组的细胞迁移率均小于10%GelMA水凝胶组(P胶支架浸提液诱导HUVECs迁移的能力最强,明显优于化学冻融法组(P胶组(P胶组和对照组均可以观察到较多的初级毛细血管样网络,而在化学冻融法组和消化冻融法组只能观察到一些不明显的管状结构形成。定量分析显示各组成管的节点数、网眼数、总主干长度均存在统计学差异(P胶组促HUVECs管状化的程度最高,化学冻融法组和消化冻融法组的促HUVECs管状化的程度最低。各组支架复合HUVECs体外培养3d、7d,RT-q PCR检测显示10%GelMA水凝胶组的成血管相关基因Ang-1、VEGF、CD31、HIF1-α、e NOS明显高于化学冻融法组(P胶组(P胶组的成血管相关基因表达随时间增加,化学冻融法组和消化冻融法组则没有随时间增加的趋势。各组支架复合HUVECs共培养3d,ELISA检测显示10%GelMA水凝胶组的VEGF蛋白表达水平最高,显著高于化学冻融法组(P胶组(P沃顿胶脱细胞支架的阳性面积显著小于10%

关键词：沃顿胶组织工程血管水凝胶支架

新型沃顿胶脱细胞软骨支架促进软骨损伤修复的研究

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新型沃顿胶脱细胞软骨支架促进软骨损伤修复的研究

作者：高发维中南大学

学位级别：硕士

目的:基于脐带沃顿胶制备新型脱细胞软骨支架,探究其负载人骨髓间充质干细胞(h BMSCs)体外构建组织工程软骨的作用及修复SD大鼠膝关节软骨缺损的效果。方法:(1)采用化学冻融法(CFT)制备新型沃顿胶脱细胞软骨支架(d WJECM)并进行大体形... 详细信息

目的:基于脐带沃顿胶制备新型脱细胞软骨支架,探究其负载人骨髓间充质干细胞(h BMSCs)体外构建组织工程软骨的作用及修复SD大鼠膝关节软骨缺损的效果。方法:(1)采用化学冻融法(CFT)制备新型沃顿胶脱细胞软骨支架(d WJECM)并进行大体形态及微观结构观察,测定支架的孔径、孔隙率、密度、溶胀率、降解率等一般理化性能,并与消化冻融法(DFT)制备的d WJECM支架对比分析。(2)以h BMSCs为种子细胞,复合不同方法制备的d WJECM支架体外构建组织工程软骨。采用CCK8细胞增殖实验、细胞活死染色实验对支架进行生物相容性检测,以HE、番红固绿、甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化、q RT-PCR评价h BMSCs在支架内的生长及向软骨分化情况。(3)构建SD大鼠膝关节软骨缺损的动物模型,植入不同方法制备的支架材料,于术后6周、12周取SD大鼠软骨缺损标本进行大体观察、Micro-CT、HE、番红固绿、甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化评价软骨缺损区域的修复情况。结果:(1)两种d WJECM支架均呈三维多孔、网状交错结构,孔隙排列疏松,相较而言CFT-d WJECM支架排列更为紧密。组织学染色显示沃顿胶的原有细胞基本脱除,番红固绿、甲苯胺蓝、天狼猩红染色均呈阳性,表明两种方法制备的支架均含糖胺聚糖、胶原。在一般理化性能方面,CFT-d WJECM支架具有更小的孔径及孔隙率,更高的密度、溶胀率及降解速率。(2)体外构建组织工程软骨结果显示,两组复合物体系中的细胞增殖情况良好,存活率均在90%以上,表明d WJECM支架具有良好的生物相容性。组织学染色(HE、番红固绿、甲苯胺蓝、II型胶原免疫组化)显示,随时间的增长CFTd WJECM支架组细胞分泌的基质较DFT-d WJECM支架组具有更强染色阳性表现,q RT-PCR结果显示第7天、21天时CFT-d WJECM支架组的COL2A1、SOX9、ACAN表达高于DFT-d WJECM支架组(P胶原、糖胺聚糖。(3)将d WJECM支架植入SD大鼠膝关节软骨缺损模型后,随时间的增长,缺损区域逐渐获得软骨的再生修复。Micro-CT结果显示三组均有一定程度软骨下骨的修复,其中CFT-d WJECM支架组最佳,形态接近周围正常骨小梁。组织学染色(HE、番红固绿、甲苯胺蓝、II型胶原免疫组化)结果显示,植入d WJECM支架的缺损模型修复过程中可产生更多的II型胶原、糖胺聚糖,其中CFT-d WJECM支架组修复程度最佳。结论:(1)d WJECM支架具备组织工程软骨支架的一般性能要求,可在体外促进h BMSCs的向软骨分化,体内促进SD大鼠膝关节软骨缺损的修复,为软骨组织工程支架材料的选择提供新的思路。(2)相较而言,化学冻融法制备的d WJECM支架可达到更佳的软骨修复效果,是更适宜的d WJECM支架脱细胞方法。图23幅,表15个,参考文献62篇

关键词：软骨修复组织工程沃顿胶细胞外基质支架

基于光交联脱细胞沃顿胶的3D生物打印软骨仿生预构体用于关节软骨缺损修复的研究

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基于光交联脱细胞沃顿胶的3D生物打印软骨仿生预构体用于关节软骨...

作者：胡贯淮新乡医学院

学位级别：硕士

背景关节软骨损伤常见,给个人和社会国家带来沉重的负担,且已有的临床治疗手段效果不一。目前,3D生物打印组织工程软骨修复关节软骨缺损已成为一种有前景的治疗方法。然而,由于缺乏理想的可以仿生软骨组织细胞外基质组成及软骨诱导活... 详细信息

背景关节软骨损伤常见,给个人和社会国家带来沉重的负担,且已有的临床治疗手段效果不一。目前,3D生物打印组织工程软骨修复关节软骨缺损已成为一种有前景的治疗方法。然而,由于缺乏理想的可以仿生软骨组织细胞外基质组成及软骨诱导活性的生物墨水,基于3D生物打印技术的软骨仿生组织的构建仍然非常困难。人体来源的沃顿胶具有良好的生物相容性、较低的免疫原性,软骨相似的细胞外基质组成和一定的软骨分化诱导能力。但迄今为止,基于脱细胞沃顿胶制备生物墨水并进行3D生物打印软骨仿生组织的预构仍然是一个显著的挑战。目的开发一种基于脱细胞沃顿胶的新型生物墨水,探讨其理化性质、生物相容性、软骨诱导活性和可打印性,并进一步结合3D生物打印技术构建组织工程软骨仿生预构体用于关节软骨缺损的修复。方法(1)制备脱细胞沃顿胶,并通过蛋白组学鉴定沃顿胶和脱细胞沃顿胶的蛋白组成,然后通过酶解、甲基丙烯酰酐改性合成甲基丙烯酰酐修饰的脱细胞沃顿胶。(2)对AWJMA/Gel MA、Gel MA、AWJMA三种水凝胶进行流变学性能、力学性能、溶胀性能、降解性能及微观结构的检测。(3)CCK8法测定AWJMA对BMSCs的影响,活死染色评估AWJMA/Gel MA水凝胶的生物相容性。(4)通过RT-q PCR检测探讨脱细胞沃顿胶对BMSCs软骨分化的作用,通过COL2免疫荧光检测AWJMA/Gel MA水凝胶对BMSCs软骨分化的作用。(5)温度扫描流变学分析水凝胶的温度敏感性,探讨并优化AWJMA/Gel MA水凝胶的相关打印参数。活死染色和鬼笔环肽染色分析BMSCs在3D生物打印支架中的细胞活性和形态。(6)使用3D生物打印软骨仿生预构体修复兔膝关节软骨缺损,并于术后6周和12周采集兔膝关节标本进行大体观察和组织学检查,通过ICRS和MODS评分标准对软骨修复情况进行量化分析。结果(1)成功制备了具有光固化能力的脱细胞沃顿胶。蛋白组学的分析结果表明沃顿胶和脱细胞沃顿胶均含有软骨活性诱导因子。(2)Gel MA的引入提高了AWJMA/Gel MA水凝胶的力学性能,同时也使AWJMA/Gel MA水凝胶具备了更为合适的降解、溶胀等理化性质。(3)CCK8结果表明AWJMA具有良好的生物相容性和促增殖能力,活死染色结果证实AWJMA/Gel MA水凝胶可以为细胞在其内部的生长与增殖提供良好的环境。(4)RT-q PCR检测结果显示脱细胞沃顿胶促使了BMSCs软骨特异性基因的显著上调,COL2免疫荧光检测表明AWJMA/Gel MA水凝胶较单纯Gel MA水凝胶更有利于其负载的BMSCs的成软骨分化。(5)温度扫描流变学测试显示AWJMA/Gel MA水凝胶具备温度敏感性,可以用于需要一定粘度的挤出式3D打印。活死染色和鬼笔环肽染色表明BMSCs在3D生物打印AWJMA/Gel MA水凝胶中具有较高的细胞活力、良好的细胞形态。(6)体内实验表明实验组3D打印软骨仿生预构体具有最好的软骨缺损修复效果。结论脱细胞沃顿胶和甲基丙烯酰修饰的脱细胞沃顿胶具有良好的生物相容性和一定的软骨分化诱导活性。引入Gel MA并与AWJMA联合所制备的生物墨水,具有较为合适的理化性质和理想的生物活性,有利于软骨仿生预构体的3D构建,并最终在研究中实现了令人满意的膝关节全层软骨缺损修复效果。总之,基于光固化脱细胞沃顿胶的生物墨水构建的3D生物打印软骨仿生预构体是很有前途的膝关节软骨缺损修复方法。

关键词：沃顿胶光交联水凝胶 3D生物打印关节软骨修复

新型沃顿胶硫酸软骨素复合支架负载hUCMSCs修复大鼠膝关节软骨缺损效果的实验研究

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新型沃顿胶硫酸软骨素复合支架负载hUCMSCs修复大鼠膝关节软骨缺...

作者：吴琪泰山医学院

学位级别：硕士

目的关节软骨损伤是骨科较为常见的一种疾病。由于缺乏血管、神经支配,一旦损伤,很难自身修复。因此,多年以来一直是骨科及运动创伤领域研究的重点。本研究以脐带中的沃顿胶为原料,复合硫酸软骨素制备新型复合支架,探索该支架作为组织... 详细信息

目的关节软骨损伤是骨科较为常见的一种疾病。由于缺乏血管、神经支配,一旦损伤,很难自身修复。因此,多年以来一直是骨科及运动创伤领域研究的重点。本研究以脐带中的沃顿胶为原料,复合硫酸软骨素制备新型复合支架,探索该支架作为组织工程软骨的可行性,并将人脐带间充质干细胞与新型支架复合后移植到SD大鼠膝关节软骨缺损处,评价这种方法修复大鼠膝关节软骨损伤的效果。方法1.体外实验分离脐带,获取沃顿胶,采取Ⅱ型胶原酶消化法制备出人脐带间充质干细胞,并应用免疫荧光技术对细胞进行鉴定,进行成软骨诱导分化培养21天。分离的沃顿胶采用机械粉碎、低渗法、酶消化法、反复冻融及差速离心技术脱细胞,制备出脱细胞完全的纳米级沃顿胶悬液,通过模具预冻,冷冻干燥机成型,制备出单纯沃顿胶支架,将单纯沃顿胶支架与硫酸软骨素通过物理及化学方法交联,制备出新型复合支架。石蜡切片,HE染色、电子扫描电镜进行结构观察。通过甲苯胺蓝染色检测其成分。使用英斯特朗生物力学检测仪检测其生物力学性能。2.体内动物实验制作SD大鼠膝关节软骨缺损动物模型,缺损区域选择股骨滑车处,制备直径2mm,深2mm的骨软骨圆柱形缺损。实验分为空白对照组、单纯沃顿胶+hUCMSCs组、复合支架+hUCMSCs组。每组10只SD大鼠。培养4周、12周后取材,分别采用大体观察,HE染色、甲苯胺蓝染色、番红O固绿染色、II型胶原免疫组织化学检测及组织学评分观察修复情况。结果1.体外实验(1)人脐带间充质干细胞的分离及鉴定:成功分离获得人脐带间充质干细胞(hUCMSCs),经免疫荧光鉴定,同时表达间充质干细胞表面标志物CD44、CD90。hUCMSCs细胞团成软骨诱导培养经阿尔新蓝染色呈蓝色。(2)支架的制备:制备出的沃顿胶硫酸软骨素复合支架具有三维立体取向多孔结构,孔隙率达到90%以上,符合软骨组织工程支架要求,且富含软骨细胞外基质糖胺多糖,生物力学检测结果显示该支架具有一定的抗压缩性能,复合支架的杨氏模量高于单纯支架,以B组复合支架杨氏模量最高,抗压缩性能最佳。2.体内动物实验(1)大体观察及评分结果:术后12周时,与单纯沃顿胶支架+hUCMSCs组和空白对照组相比,复合支架+hUMSCs组修复组织色泽与正常软骨组织非常接近,修复平面平整,与周围正常组织整合良好。大体观察评分结果为:复合支架+hUCMSCs组沃顿胶支架+hUCMSCs组沃顿胶支架+hUCMSCs组相比,复合支架+hUCMSCs组在术后4周、12周经甲苯胺蓝染色、番红O固绿染色、Ⅱ型胶原免疫组化检测,富含更多的糖胺多糖及Ⅱ型胶原,生成的软骨与正常的软骨更接近,且组织学评分复合支架+hUCMSCs组沃顿胶+hUCMSCs组沃顿胶成功分离出人脐带间充质干细胞,具有成软骨潜能。制备的人脐带沃顿胶硫酸软骨素复合支架为三维多孔结构,物理性能及力学性能符合软骨组织工程支架要求,具有良好的生物相容性,在支架上接种hUCMSCs后,生长较好。2.新型沃顿胶硫酸软骨素复合支架负载hUCMSCs修复SD大鼠膝关节骨软骨缺损效果良好。该支架为软骨组织工程支架材料的选择提供了新的思路。意义本课题通过体内及体外实验,探究新型沃顿胶硫酸软骨素复合支架作为软骨组织工程支架材料的可行性,为软骨损伤的治疗探索新的治疗方法。

关键词：关节软骨软骨组织工程支架材料沃顿胶硫酸软骨素软骨修复

新型沃顿胶硫酸软骨素复合支架体外构建组织工程软骨的实验研究

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泰山医学院学报 2017年第9期38卷 969-972页

作者：吴琪亓建洪泰山医学院

目的以脐带中的沃顿胶为原料,复合硫酸软骨素制备新型复合支架,检测该支架的性能,并与分离的人脐带间充质干细胞共培养,构建组织工程软骨。方法分离脐带,去除被膜及血管,得到沃顿胶,采用Ⅱ型胶原酶消化法获得人脐带间充质干细胞,通过流... 详细信息

目的以脐带中的沃顿胶为原料,复合硫酸软骨素制备新型复合支架,检测该支架的性能,并与分离的人脐带间充质干细胞共培养,构建组织工程软骨。方法分离脐带,去除被膜及血管,得到沃顿胶,采用Ⅱ型胶原酶消化法获得人脐带间充质干细胞,通过流式细胞仪鉴定;以沃顿胶为原料,通过机机械粉碎、差速离心法、反复冻融去细胞,真空冷冻干燥成型、物理及化学交联的方法制备出三维支架,通过电镜观察支架结构,检测物理性能,与获得的间充质干细胞共培养诱导为组织工程软骨,通过组织化学染色及免疫组织化学的方法进行检测成分。结果分离的人脐带间充质干细胞CD44、CD90表达阳性,CD34表达阴性。制备出的沃顿胶硫酸软骨素复合支架具有三维立体取向结构,孔隙率达到90%以上,符合软骨组织工程支架要求,且富含糖胺多糖及Ⅱ型胶原,将人脐带间充质干细胞复合到支架上,经诱导培养生成软骨样物质,甲苯胺蓝染色阳性。结论从脐带沃顿胶分离出人脐带间充质干细胞,制备的复合支架为三维多孔结构,物理性能符合软骨组织工程支架要求,具有良好的生物相容性,在支架上接种脐带间充质干细胞后,生长较好,并可促使其成软骨分化。为软骨组织工程支架材料的选择提供了新的思路。

关键词：人脐带间充质干细胞软骨组织工程沃顿胶支架硫酸软骨素

人脐带沃顿胶间充质干细胞体外分离条件的优化及传代效应的流式细胞学检测

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天津医药 2015年第2期43卷 142-146页

作者：洪敬欣李茜韩俊领协和干细胞基因工程有限公司天津300384 中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院

目的观察不同胶原酶消化方法对人脐带沃顿胶间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）分离和培养结果的影响,并鉴定其分化潜能;探讨传代效应对其免疫表型的影响。方法将制备好的脐带标本分别加入Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅳ型胶原酶,持续消化4-18... 详细信息

目的观察不同胶原酶消化方法对人脐带沃顿胶间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）分离和培养结果的影响,并鉴定其分化潜能;探讨传代效应对其免疫表型的影响。方法将制备好的脐带标本分别加入Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅳ型胶原酶,持续消化4-18 h,筛网过滤,离心收集细胞,用DMEM/F12培养基重悬细胞,调整细胞密度4.8×10^3-1×10^4/cm^2,接种培养,比较不同消化法分离人脐带沃顿胶MSC的效果。Von kossa钙结节染色、四环素荧光标记鉴定人脐带沃顿胶MSC向成骨方向分化的能力,RT-PCR鉴定其向心肌细胞分化的能力。应用流式细胞仪检测连续传代后MSC的免疫表型变化。结果Ⅰ型胶原酶消化法能够从人脐带沃顿胶获取了数量较多、活力较高的MSC,而且细胞出现伸展的时间及原代培养时间均短于Ⅱ型胶原酶及Ⅳ型胶原酶消化法。表面标记分析显示：随着传代次数的增加,阳性标记CD29、CD44、CD73、CD90、CD105的表达百分率没有变化,而阴性标记CD31、CD34和HLA-DR的表达率增加明显。体外诱导实验表明：来源于人脐带沃顿胶的MSC具有体外成骨和成心肌样细胞分化的能力。结论Ⅰ型胶原酶消化法简单易行,对细胞损伤小,能稳定、高效地从人脐带沃顿胶中分离出MSC。

关键词：脐带间质干细胞胶原酶类传代效应沃顿胶

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