新型沃顿胶脱细胞软骨支架抑血管效应的研究

作     者：齐军 

作者单位：中南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：钟达

授予年度：2023年

学科分类：08[工学] 080501[工学-材料物理与化学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 080502[工学-材料学] 

主      题：沃顿胶 组织工程 血管 水凝胶支架 

摘      要：目的:基于脐带沃顿胶制备新型脱细胞软骨支架,研究化学冻融法和消化冻融法沃顿胶脱细胞支架在体外和体内抑血管生成的效应。方法:(1)使用化学冻融法和消化冻融法制备沃顿胶脱细胞支架,以目前软骨组织工程中广泛应用的10%GelMA水凝胶支架作为对照,制作化学冻融法和消化冻融法沃顿胶脱细胞支架、10%GelMA水凝胶支架并观察大体形态,HE染色观察支架微结构,测定支架的密度、孔隙率、溶胀率、降解率等理化性质。(2)配制各组支架浸提液,通过细胞死活染色、CCK-8检测各组支架的生物相容性;各组支架复合HUVECs共培养,通过VEGF免疫荧光染色、CCK-8检测支架促HUVECs增殖的能力;通过Scratch实验、Transwell迁移实验检测各组支架浸提液促HUVECs迁移的能力;通过Matrigel小管形成实验检测各组支架浸提液促HUVECs成管化的能力;RT-q PCR检测各组支架复合HUVECs体外培养3d、7d的成血管相关基因表达情况;ELISA检测各组支架复合HUVECs体外培养3d时的VEGF蛋白表达情况。(3)制备三组支架埋入裸鼠皮下,1周、2周、3周后取材行VEGF免疫荧光染色,并通过RT-q PCR检测各组皮下包埋支架的成血管相关基因的表达情况。结果:(1)化学冻融法和消化冻融法制备的沃顿胶脱细胞支架大体观呈现奶酪色、疏松多孔状,有一定的韧性,10%GelMA水凝胶支架呈现透明胶冻状,有较强的粘性和一定的弹性;密度:10%GelMA水凝胶支架化学冻融法沃顿胶脱细胞支架消化冻融法沃顿胶脱细胞支架;孔隙率:消化冻融法沃顿胶脱细胞支架化学冻融法沃顿胶脱细胞支架10%GelMA水凝胶支架;三组支架的溶胀率无统计学差异;降解率:化学/消化冻融法沃顿胶脱细胞支架10%GelMA水凝胶支架。(2)细胞死活染色显示各组支架浸提液培养的HUVECs均生长良好,无明显死细胞,细胞密度:10%GelMA水凝胶支架组对照组化学/消化冻融法沃顿胶支架组。CCK-8检测各组浸提液培养HUVECs存活率均大于75%,各组支架生物相容性良好。各组支架复合HUVECs共培养3d、7d,VEGF免疫荧光染色显示化学和消化冻融法沃顿胶脱细胞支架的阳性面积显著小于10%GelMA水凝胶支架(P0.05);24h时,化学冻融法组和消化冻融法组的细胞迁移率均小于10%GelMA水凝胶组(P0.001)和对照组(P0.001)。Transwell细胞迁移实验显示10%GelMA水凝胶支架浸提液诱导HUVECs迁移的能力最强,明显优于化学冻融法组(P0.001)、消化冻融法组(P0.001)和对照组(P0.001);化学冻融法和消化冻融法组支架浸提液诱导HUVECs迁移的能力明显弱于10%GelMA水凝胶组(P0.001)和对照组(P0.001)。Matrigel小管形成实验显示10%GelMA水凝胶组和对照组均可以观察到较多的初级毛细血管样网络,而在化学冻融法组和消化冻融法组只能观察到一些不明显的管状结构形成。定量分析显示各组成管的节点数、网眼数、总主干长度均存在统计学差异(P0.05),10%GelMA水凝胶组促HUVECs管状化的程度最高,化学冻融法组和消化冻融法组的促HUVECs管状化的程度最低。各组支架复合HUVECs体外培养3d、7d,RT-q PCR检测显示10%GelMA水凝胶组的成血管相关基因Ang-1、VEGF、CD31、HIF1-α、e NOS明显高于化学冻融法组(P0.05)、消化冻融法组(P0.05)和对照组(P0.05);化学冻融法组、消化冻融法组的成血管相关基因Ang-1、VEGF、CD31、HIF1-α、e NOS明显低于10%GelMA水凝胶组(P0.05)和对照组(P0.05)。10%GelMA水凝胶组的成血管相关基因表达随时间增加,化学冻融法组和消化冻融法组则没有随时间增加的趋势。各组支架复合HUVECs共培养3d,ELISA检测显示10%GelMA水凝胶组的VEGF蛋白表达水平最高,显著高于化学冻融法组(P0.001)、消化冻融法组(P0.001)和对照组(P0.001);而化学冻融法组、消化冻融法组的VEGF蛋白表达水平最低,显著低于10%GelMA水凝胶组(P0.001)和对照组(P0.001)。(3)裸鼠皮下包埋支架VEGF免疫荧光染色结果显示2周、3周时,化学和消化冻融法沃顿胶脱细胞支架的阳性面积显著小于10%