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治疗杜兴肌肉萎缩症的新药及其开发

中国新药杂志 2020年第2期29卷 165-169页

作者：卜鑫珏奚鑫刘松青杜倩重庆医科大学附属第三医院(捷尔医院) 重庆401120

杜兴肌肉萎缩症(DMD)是由抗肌萎缩(dystrophin)蛋白基因发生突变导致的一种进行性、致死性的疾病,患者多为男性,治疗过程涉及多学科、多专业。目前糖皮质激素治疗是应用最广泛的治疗方法,但该方法并不能恢复肌肉中dystrophin蛋白表达,... 详细信息

杜兴肌肉萎缩症(DMD)是由抗肌萎缩(dystrophin)蛋白基因发生突变导致的一种进行性、致死性的疾病,患者多为男性,治疗过程涉及多学科、多专业。目前糖皮质激素治疗是应用最广泛的治疗方法,但该方法并不能恢复肌肉中dystrophin蛋白表达,因此治疗效果有限。近年来,随着治疗技术的发展,基因治疗取得了丰硕的成果,是该病目前唯一有效的根治方法,并且已有新药上市。本文对糖皮质类激素治疗和基因治疗的研究进展等加以阐述。

关键词：抗肌萎缩蛋白基因治疗杜兴肌肉萎缩症地氟可特

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营养物对杜兴肌肉萎缩症小鼠的作用研究

营养物对杜兴肌肉萎缩症小鼠的作用研究

作者：宁含含天津医科大学

学位级别：硕士

杜兴肌肉萎缩症(Duchenne Muscular Dystrophy,DMD)是一种伴X染色体连锁隐性遗传的影响神经和肌肉的系统性疾病,主要发病原因为DMD基因突变引起dystrophin蛋白缺失,肌肉细胞膜发生破损,肌肉出现进行性退化,导致病人死亡,DMD病人的平均... 详细信息

杜兴肌肉萎缩症(Duchenne Muscular Dystrophy,DMD)是一种伴X染色体连锁隐性遗传的影响神经和肌肉的系统性疾病,主要发病原因为DMD基因突变引起dystrophin蛋白缺失,肌肉细胞膜发生破损,肌肉出现进行性退化,导致病人死亡,DMD病人的平均寿命约为20岁。目前对DMD缺乏有效的治疗手段,唯一被批准用于临床的反义寡核苷酸药物PMO(phosphorodiamidate morpholino oligomers)存在系统运输效率低、用药量大、价格昂贵等问题。针对这些问题,我们利用DMD疾病模型mdx小鼠筛选营养物,以期获得能够促进PMO活性及改善DMD病理的新型佐剂。基于课题组前期的局部筛选结果,本论文选择了局部筛选效果较好的三种营养物(A1-A3),在mdx小鼠上系统评估这三种营养物对PMO活性的作用及对肌肉组织形态、炎症、纤维化、新生和退化进程等的影响;为进一步明确候选营养物的长期有效性及安全性,我们在mdx小鼠上进行了较为长期的系统研究,以期为其临床应用提供试验依据和理论基础。测试结果表明,在成年mdx小鼠上,通过尾静脉系统注射营养物A1和25mg/kg PMO,按每周注射一次,连续注射3次的注射周期,A1未对PMO活性产生促进作用;对肌肉病理无明显改善效果。按同样的剂量和给药周期,在成年mdx小鼠上对A2和A3的系统测试结果表明:A2和A3能够促进PMO活性,与生理盐水相比,A2对PMO介导的dystrophin蛋白表达水平的提高约为10%的正常水平;A3对PMO介导的dystrophin蛋白表达水平的提高约为4%的正常水平。在研究中发现,通过提高A2或A3的给药频率,可以进一步改善肌肉病理状态,但对PMO活性增强无明显效果。基于前期的研究结果,我们在成年mdx小鼠上,对营养物A3进行了系统的评估。结果表明:营养物A3能够显著改善mdx小鼠肌肉的病理、延缓炎症和抑制纤维化进程,并提高肌肉的抓力和耐力。尤为重要的是,长期使用A3未诱导任何药物相关毒副作用。综上所述,本论文对三种营养物在杜兴肌肉萎缩症小鼠模型上进行了系统研究,评估其对PMO药物活性的增强作用及对肌肉病理的改善情况。结果表明:营养物A2和A3能够促进反义寡核苷酸药物PMO的活性,提高PMO介导的dystrophin蛋白的恢复表达,而且改善DMD肌肉组织病理状态。对营养物A3在mdx小鼠上的系统评估表明:营养物A3可以改善mdx小鼠肌肉病理及功能,且未表现出任何毒副作用。本论文为DMD的反义寡核苷酸药物介导的外显子跳读治疗及辅助治疗提供一种新型佐剂。

关键词：杜兴肌肉萎缩症营养物反义寡核苷酸药物辅助治疗功能改善

负载myostatin-propeptide的Exosome在杜兴肌肉萎缩症上的功能研究

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负载myostatin-propeptide的Exosome在杜兴肌肉萎缩症上的功能研究

作者：冉宁天津医科大学

学位级别：硕士

目的:杜兴肌肉萎缩症（Duchenne Muscular Dystrophy-DMD）是一种罕见遗传性疾病,是由编码dystrophin蛋白的DMD基因突变导致功能性dystrophin蛋白缺失而引起。该疾病在新生男孩中的发病率为1/3500,主要表现为进行性肌肉萎缩,疾病发展后... 详细信息

目的:杜兴肌肉萎缩症（Duchenne Muscular Dystrophy-DMD）是一种罕见遗传性疾病,是由编码dystrophin蛋白的DMD基因突变导致功能性dystrophin蛋白缺失而引起。该疾病在新生男孩中的发病率为1/3500,主要表现为进行性肌肉萎缩,疾病发展后期出现心肌肥大、呼吸衰竭等症状,最终导致病人死亡。目前临床上尚无有效的治疗DMD的方法,对DMD治疗研究主要集中于缓解DMD病人肌肉萎缩症状及恢复功能性dystrophin蛋白表达,其中以肌肉生长抑制因子（myostatin）为主要作用靶点的辅助治疗研究受到广泛关注。其作用机制是通过其前体短肽myostatin-propeptide抑制myostatin的活性,解除myostatin对肌肉的负性调控作用,促进肌肉再生分化,达到缓解DMD所引起的肌肉萎缩的目的。众所周知,短肽在血液中极不稳定,半衰期较短,而本课题组前期研究发现,哺乳类细胞分泌的一种纳米级囊泡结构-外泌体（exosome）,可作为蛋白和核酸药物的运输载体,并对核酸起到一定保护作用。因此,在本研究中,我们拟利用杜兴肌肉萎缩症小鼠模型（mdx小鼠）,系统研究exosome作为propeptide短肽运输载体的可行性和应用潜力,通过检测负载propeptide短肽的exosome对DMD肌肉的改善作用,以期为DMD治疗提供一种新型药物运输载体和治疗手段。方法:利用RT-PCR获取小鼠myostatin propeptide基因序列,构建CD63-propeptide（CD63-Pro）融合表达质粒。利用慢病毒感染小鼠NIH3T3细胞系,获得稳定表达CD63-Pro融合短肽的细胞系。通过超速离心和超滤法收集CD63-Prop融合表达细胞分泌的外泌体（EXOmyo-pro）,利用Western Blot检测确认稳定表达细胞系及其分泌外泌体中propeptide的表达水平。为确定EXOmyo-pro与血清中myostatin的结合能力,将EXO或EXOmyo-pro以10mg/kg剂量通过尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内,在循环24h后,收集血清,离心去除血清中外泌体,再利用Western Blot检测血清中myostatin表达。分别在细胞模型、CTX损伤的C57BL/6急性损伤和dystrophin蛋白缺失的mdx小鼠模型上,系统测试不同剂量EXOmyo-pro对肌肉细胞、急性和慢性肌肉损伤的再生修复作用。利用H＆E染色检测损伤组织形态及肌纤维面积、IHC检测胚胎肌球重链（e My HC）表达以评估修复效果;Western Blot检测分化相关标志蛋白Myo D、Myo G表达以确定EXOmyo-pro对肌肉分化的影响。除此之外,在mdx小鼠上系统测试EXOmyo-pro反复给药对mdx小鼠体重、抓力、肌肉重量及肌纤维面积等的改善情况以确定其作用效果。结果:成功构建CD63-Pro融合表达的NIH3T3细胞系,并证明融合表达细胞及其分泌的exosomes中表达propeptide。与血清中myostatin的结合试验表明:EXOmyo-pro能够显著降低小鼠血清中myostatin表达,说明EXOmyo-pro能够与血清中的myostatin高效结合。体外细胞试验结果显示,EXOmyo-pro处理组较对照组Myo G表达升高,说明EXOmyo-pro能够抑制myostatin活性,从而促进细胞分化。在C57BL/6局部肌肉急性损伤模型上的测试结果显示,与对照组相比,EXOmyo-pro处理组肌肉重量增加、肌纤维面积增大、e My HC表达增加,说明EXOmyo-pro能够增强急性损伤后的肌肉再生修复能力。在mdx小鼠上的不同剂量测试表明,与10mg/kg三次注射相比,20mg/kg三次注射能够显著提高mdx小鼠肌肉功能及肌纤维分化再生能力。在mdx小鼠上按20mg/kg的剂量重复注射的结果表明:与单次注射相比,多次重复注射能够显著增加mdx小鼠体重、肌肉重量及抓力;EXOmyo-pro处理组Myo D、Myo G表达明显升高,说明EXOmyo-pro对mdx小鼠肌肉再生、分化及增殖具有累积作用。与3次重复注射相比,5次EXOmyo-pro连续注射对mdx小鼠肌肉增殖、分化等具有显著增强效果。结论:我们的研究结果表明:exosome可作为myostatin--propeptide的运输载体能够与血清中myostatin高效结合并抑制myostatin活性,从而促进损伤肌肉的再生、增殖和分化,改善mdx小鼠肌肉状态,为propeptide介导的DMD辅助治疗提供一种新型运输载体系统。

关键词：杜兴肌肉萎缩症外泌体 Propeptide 肌肉抑素

肌肉细胞来源exosome的分析鉴定及在杜兴肌肉萎缩症小鼠模型上的初步研究

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肌肉细胞来源exosome的分析鉴定及在杜兴肌肉萎缩症小鼠模型上的...

作者：牛鸿婧天津医科大学

学位级别：硕士

目的:Exosome是一种大小在40-100 nm之间的囊泡状膜结构,不同细胞来源的exosome含有不同的蛋白和RNA成分。Exosome在抗原呈递、细胞间信息传递和运输等过程中起着重要的作用。由于exosome能够获取源细胞中的多种蛋白或RNA（mRNA和micro... 详细信息

目的:Exosome是一种大小在40-100 nm之间的囊泡状膜结构,不同细胞来源的exosome含有不同的蛋白和RNA成分。Exosome在抗原呈递、细胞间信息传递和运输等过程中起着重要的作用。由于exosome能够获取源细胞中的多种蛋白或RNA（mRNA和microRNA）,并进行细胞间传递,是细胞内信使及内源性蛋白和RNA的运输载体。因此我们在前期工作中,利用小鼠未成熟树突状细胞来源的exosome作为运输载体,来尝试运输外源siRNA药物。通过对exosome特异性靶向修饰,赋予其靶向脑神经的能力,从而成功地将siRNA运输到脑神经中,介导特异性靶基因下调,证明exosome可以作为外源基因的运输载体。因此在本论文中,我们尝试利用exosome运输反义寡核苷酸药物,并以杜兴肌肉萎缩症（DMD）作为疾病测试模型评估exosome作为反义寡核苷酸药物载体的能力和潜力。DMD是由dystrophin基因突变导致的dystrophin蛋白缺失所引发的一种致死性神经肌肉失调症,到目前为止,临床上未有任何有效的治疗方法。反义寡核苷酸介导的外显子跳读的治疗方法是最有应用前景的治疗方法之一,已处于临床Ⅲ期试验,结果喜人。然而临床上测试的反义寡核苷酸药物存在系统运输效率低的问题,本研究拟以exosome作为反义寡核苷酸药物的运输载体,以期提高反义寡核苷酸药物在肌肉中的系统运输效率。方法:***的制备：利用多步超速离心法。首先通过1000 g,15 mins离心去除细胞碎片;取上清,利用12,000 g,20 mins离心后,再用0.22 μm滤膜过滤,去除杂质;收集上清,通过100,000 g,超速离心70 mins,用PBS重悬沉淀,获得 exosome。***的生化鉴定:利用exosome的标志性蛋白Alix和TSG101,通过Western Blot来检测exosome的存在;为确定无细胞碎片的污染,使用细胞器线粒体中的蛋白Cytochrome C作为检测指标。***的形态鉴定:利用透射电子显微镜观察exosome形态特征。将醋酸铵重悬的exosome滴加到附有碳膜的铜网上5 mins,弃去剩余液体后自然干燥。滴加1%磷钨酸染液2 mins,弃去染液,干燥后用透射电镜观察。***的密度确认:利用蔗糖梯度离心的方法,检测exosome的密度。制备1.07-1.25 g/mL的蔗糖密度梯度溶液,按密度由大到小依次加入到超速离心管,在最上层加入一定量exosome悬浮液,经100,000 g,16 h超速离心,分别收集每一密度梯度层的蔗糖溶液,并将其中的exosome沉淀、分离,用PBS重悬定量。***进入源细胞的能力测试:使用膜特异标记染料PKH67对肌肉细胞来源的exosome进行标记,并加入到肌肉细胞C2C12中,在不同时间点观察其进入细胞情况,确定exosome进入其源细胞的最佳时间点。***在细胞内的定位:将PKH67标记的exosome加入肌肉细胞,利用细胞器例如溶酶体特异标记染料和早期内体（Early Endosome）特异标记染料,来检测exosome在细胞内的位置。***的细胞或组织趋向性分析:检测PKH67标记的exosome进入不同细胞包括肌肉细胞、脂肪前体细胞及成纤维细胞的能力。通过荧光显微镜和流式细胞分析确定肌肉细胞来源的exosome的细胞趋向性;并检测荧光标记exosome在mdx小鼠中各组织中的分布情况,以确定肌肉细胞来源的exosome是否具有肌肉趋向性。***运输反义寡核苷酸药物的体外检测:通过电击转化的方法将反义寡核苷酸装载入exosome,并在DMD细胞模型中检测其运输反义寡核苷酸药物的效率。***运输反义寡核苷酸药物的体内局部检测:将装载反义寡核苷酸的exosome通过肌肉局部注射,注射到mdx小鼠前径骨肌中,两周后取样检测。通过免疫组织化学染色法和RT-PCR检测模型小鼠肌肉纤维的恢复情况及外显子跳读的效率。结果:1.通过多步离心法,从细胞的培养上清中提取到exosome,并通过蛋白定量的方法,确定每毫升细胞培养上清可提取5 μg exosome。2.通过Western Blot方法,利用exosome标志性蛋白Alix和TSG101,确定获得了肌肉细胞来源的exosome;同时通过检测细胞器上的特征性蛋白Cytochrome C,来证实所提取的exosome中无细胞碎片污染。3.通过蔗糖密度梯度离心的方法来纯化exosome,获得的exosome密度与报道一致。Western Blot实验结果确认,蔗糖梯度纯化的exosome悬浮在蔗糖密度梯度为1.13-1.19 g/mL之间,与报道的

关键词： Exosome 超速离心杜兴肌肉萎缩症蔗糖密度梯度离心电击转化

2’-0-甲氧乙基反义寡核苷酸在杜兴肌肉萎缩症上的应用研究

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2’-0-甲氧乙基反义寡核苷酸在杜兴肌肉萎缩症上的应用研究

作者：杨璐天津医科大学

学位级别：硕士

目的：杜兴肌肉萎缩症是一种由dystrophin基因突变,导致dystrophin蛋白缺失所引发的致死性神经肌肉失调症,本研究利用杜兴肌肉萎缩症疾病细胞和动物模型来测试一种新的反义寡核苷酸化学结构-2’-O-甲氧乙基(2’-O-MOE),通过对该反义寡... 详细信息

目的：杜兴肌肉萎缩症是一种由dystrophin基因突变,导致dystrophin蛋白缺失所引发的致死性神经肌肉失调症,本研究利用杜兴肌肉萎缩症疾病细胞和动物模型来测试一种新的反义寡核苷酸化学结构-2’-O-甲氧乙基(2’-O-MOE),通过对该反义寡核苷酸化学结构的体外、体内局部和系统的测试,其中包括系统给药剂量和给药途径的优化,预期为杜兴肌肉萎缩症反义寡核苷酸介导的外显子跳读的基因治疗方法提供一种候选的反义寡核苷酸药物。与此同时,通过对荧光标记的2’-O-MOE反义寡核苷酸药物体外和体内试验,来测试该反义寡核苷酸药物在肌肉细胞内的定位和摄取效率及在实验动物各组织内的分布情况。方法： 1.浓度效应试验中将300nM、500nM、1μM不同长度和骨架修饰的2’-O-MOE包括MOE20(PS).MOE25(PS)和MOE25(PO)反义寡核苷酸药物通过脂质体转染H?K mdx细胞48h后,利用RT-PCR技术检测其诱导外显子23跳读的效率。 2.时间效应试验中将500nM不同长度和骨架修饰的2’-O-MOE反义寡核苷酸药物通过脂质体转染H2K mdx细胞24h、48h、72h、96h后,利用RT-PCR技术检测其诱导外显子23跳读的效率。 3.细胞毒性试验中,应用WST试剂盒分别检测高于试验测试浓度5倍和10倍的MOE25(PS)、MOE25(PO)和MOE20(PS)对细胞增殖能力和生存率的影响。 4.不同反义寡核苷酸化学结构比较试验中,将500nM MOE25(PS)、 MOE25(PO).MOE20(PS)和2’OmePS通过脂质体转染H2K mdx细胞48h后,利用RT-PCR技术检测不同反义寡核苷酸药物诱导外显子23跳读效率的差异。 5.在mdx小鼠局部肌肉试验中.将5μg的MOE25(PS)、MOE25(PO)、MOE20(PS)和2’OmePS分别注射到成年mdx小鼠的胫前肌(tibialis anterior-TA)。注射两周后,收集肌肉组织样品。利用免疫组化、RT-PCR和Western Blot测试各反义寡核苷酸药物诱导外显子23跳读效率和dystrophin蛋白的分布及表达水平。 6.将局部肌肉测试效果较好的2’-O-MOE反义寡核苷酸通过尾静脉、腹腔和皮下注射等不同给药途径及不同的剂量进行系统测试,注射2周后,收取全身肌肉组织包括胸膈肌和心肌,利用免疫组化、RT-PCR和Western blot方法系统检测该反义寡核苷酸诱导外显子跳读和dystrophin蛋白表达的效率。 7.在动物体内组织分布试验中,将100mg/kg荧光标记的MOE25(PS)通过尾静脉隔天注射成年mdx小鼠,连续给药5次,检测该MOE25(PS)在mdx小鼠各肌肉组织中的分布情况。 8.在细胞摄取试验中,将荧光标记的MOE25(PS)通过脂质体转染H2K mdx细胞后,通过荧光显微镜检测不同时间点细胞对荧光标记MOE25(PS)的摄取情况,并利用流式细胞仪定量分析H2K mdx细胞对其摄取情况。 9.在细胞内定位试验中,将荧光标记的MOE25(PS)通过脂质体转染H2K mdx细胞4h后,通过激光扫描共聚焦荧光显微镜检测MOE(PS)在H2K mdx细胞中的定位情况,包括与细胞核和溶酶体等细胞器的共定位情况。结果： 1.在浓度效应试验中,结果表明：随着浓度的升高,3种不同2’-O-MOE反义寡核苷酸药物诱导H2K mdx细胞外显子跳读的效率也随之增加,表现出浓度依赖性效应。其中以MOE25(PS)诱导外显子23跳读效果最佳,在500nM时,已达到90%以上外显子跳读效率。 2.细胞毒性分析试验结果显示MOE25(PS)和MOE20(PS)在10μM的浓度下对细胞的增殖和生存率无影响,而MOE25(PO)在该浓度表现出对细胞轻微的毒害作用。 3.在时间效应试验中,RT-PCR结果显示：MOE25(PO)和MOE25(PS)诱导H2Kmdx细胞外显子23跳读效率最高的时间点都为转染后48h。 4.不同反义寡核苷酸化学结构比较试验中,在500nM浓度时,：RT-PCR结果显示：MOE25(PS)诱导外显子23跳读的效率显著高于2’OmePS和MOE20(PS),略高于MOE25(PO),表明MOE25(PS)是一种比2’OmePS更有效的反义寡核苷酸药物。 5.在mdx小鼠的局部肌肉注射试验中,结果表明：四种测试反义寡核苷酸都能够有效地诱导dystrophin蛋白在mdx小鼠胫前肌中的表达,其中尤为突出的是MOE25(PS),能够有效诱导dystrophin蛋白在整个肌肉组织切片上均匀分布和表达,且Western blot结果显示在MOE25(PS)处理的胫前肌中dystrophin蛋白的表达量接近于正常组织中的30%,与其他三种

关键词：杜兴肌肉萎缩症反义寡核苷酸外显子跳读抗肌萎缩蛋白甲氧乙基

小分子化合物在杜兴肌肉萎缩症治疗中的应用研究

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小分子化合物在杜兴肌肉萎缩症治疗中的应用研究

作者：林曹瑞天津医科大学

学位级别：硕士

杜兴肌肉萎缩症（Duchenne Muscular Dystrophy-DMD）是一种致死性的X染色体连锁隐性遗传神经肌肉失调症,由于DMD基因突变,导致功能性dystrophin蛋白缺失所致,目前临床上缺乏有效的治疗手段。其临床表征主要为全身肌肉进行性退化萎缩,... 详细信息

杜兴肌肉萎缩症（Duchenne Muscular Dystrophy-DMD）是一种致死性的X染色体连锁隐性遗传神经肌肉失调症,由于DMD基因突变,导致功能性dystrophin蛋白缺失所致,目前临床上缺乏有效的治疗手段。其临床表征主要为全身肌肉进行性退化萎缩,最终致死。在本研究中,拟对临床常用的食品级小分子化合物进行筛选和鉴定,通过在DMD小鼠（mdx）模型上的局部和系统测试,以期发现能够改善mdx小鼠肌肉病理、炎症和促进肌肉再生及分化的小分子化合物,为DMD辅助治疗提供新的候选药物。首先利用体外肌肉细胞模型,通过细胞计数法检测细胞增殖速度,以筛选能够增强细胞增殖的候选小分子化合物。在mdx小鼠模型上,对候选小分子化合物进行局部和系统筛选测试,通过免疫荧光、胶原和炎症病理染色等方法,以确认候选化合物对肌肉再生和病理的改善作用。为检测不同给药途径,对候选化合物作用效果的影响,拟测试饲喂和尾静脉注射两种途径,通过免疫荧光染色、H＆E染色等方法,以确认不同给药方式对候选小分子化合物作用效果的影响。为测试候选化合物长期的作用效果,拟对mdx小鼠进行为期3月的系统治疗,通过抓力测试、体重检测、血生化指标、免疫荧光染色和胶原染色等方法,以系统评估候选化合物对mdx小鼠肌肉病理、炎症和肌肉再生及分化的影响。通过免疫荧光、病理染色和流式细胞术等方法,检测候选化合物在急性损伤小鼠模型和幼龄mdx小鼠模型上对增殖活跃的肌卫星细胞增殖、再生肌纤维等的影响。为解析候选化合物的作用机制,利用Western blotting和real-time PCR等手段,检测参与肌肉再生的mTORC1信号通路相关蛋白及细胞增殖相关基因表达谱变化。同时,通过免疫荧光和病理染色,检测mTORC1抑制剂对候选化合物促进肌肉再生的抑制作用。为进一步确认候选化合物对mTORC1的调控作用,通过激光扫描共聚焦荧光显微镜检测mTORC1与溶酶体的定位情况。体外筛选结果表明:与其他处理组相比,候选化合物G1能显著地增强肌肉细胞的增殖速度,培养24h后细胞数目由8000个增殖到26000个。在mdx小鼠局部肌肉测试中,结果显示:与G2、G3和G5处理组相比,G1处理组的eMyhc阳性肌纤维数目达到326,表现为显著性差异,说明G1能够促进肌肉再生。通过对不同浓度G1的局部肌肉测试,结果发现:5%G1对mdx小鼠前胫骨肌的再生作用效果最为明显,为最佳使用浓度。在mdx小鼠上,对G1系统测试结果显示:与其他处理组相比,G1能显著促进骨骼肌中阳性再生肌纤维数目增多,其中腓肠肌和肱三头肌作用效果最为显著。对G1处理组肌肉纤维化情况的检测结果表明:与生理盐水组相比,G1能够明显降低骨骼肌中纤维化程度,其中对肱三头肌上作用效果最为明显（纤维化区域能降至5%）。给药方式优化结果表明:尾静脉注射为G1的最佳给药途径。在mdx小鼠上,对G1长期系统测试结果显示:相对于生理盐水对照组,G1能够显著提高小鼠的肌肉功能,包括小鼠抓力水平和跑轮能力;同时,肌肉组织纤维化显著改善,其中肱三头肌纤维化水平降低至9%的面积。G1处理组骨骼肌中肌卫星细胞数量显著增多,而且肌卫星标志性蛋白pax7蛋白表达水平为生理盐水组的1.6倍。G1对急性损伤C57BL6小鼠和幼龄mdx小鼠增殖活跃的肌肉卫星细胞同样具有明显的促进作用。对G1处理组肌肉中,mTORC1及mTORC1下游分子p70S6k和4E-BP1的磷酸化检测结果显示:与生理盐水组相比,G1处理组mTORC1、p70S6k和4E-BP1磷酸化水平有所增高,其中4E-BP1磷酸化呈现显著性差异。对4E-BP1下游的细胞增殖相关因子cyclinD1的mRNA表达水平检测,发现:与生理盐水组相比:G1处理组cyclinD1表达升高2倍。抑制mTORC1信号通路,能够阻断G1对肌肉再生的促进作用。对mTORC1在溶酶体的定位试验结果表明:G1可诱导mTORC1从胞质中向溶酶体膜上定位,这些结果说明G1通过活化mTORC1信号通路,从而促进肌卫星细胞活化和肌肉再生。本研究成功地在肌肉细胞模型上筛选出具有促进细胞增殖能力的候选小分子化合物;通过在mdx小鼠局部和系统测试,我们发现小分子化合物G1能够显著促进肌肉再生能力。长期的功能性评估结果表明:G1能够有效地改善mdx小鼠肌肉功能和病理状态,促进肌卫星细胞增殖和肌肉再生。研究证明:G1通过激活mTORC1信号通路,而调控肌卫星细胞增殖和肌肉再生。本研究为DMD临床辅助治疗提供一种新型候选小分子化合物;进一步完善了mTORC1信号通路。

关键词：杜兴肌肉萎缩症小分子化合物肌卫星细胞肌肉再生 mTORC1通路

新型运输辅助剂GF对肽-PMO在杜兴肌肉萎缩症小鼠上的作用研究

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新型运输辅助剂GF对肽-PMO在杜兴肌肉萎缩症小鼠上的作用研究

作者：顾犇天津医科大学

学位级别：硕士

目的:杜兴肌肉萎缩症(Duchenne muscular dystrophy-DMD)是一种X染色体连锁遗传的致死性神经肌肉失调症。DMD的致病原因为抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的基因发生突变,使得功能性dystrophin蛋白缺失。目前,在临床上未见任何有效的治疗。反... 详细信息

目的:杜兴肌肉萎缩症(Duchenne muscular dystrophy-DMD)是一种X染色体连锁遗传的致死性神经肌肉失调症。DMD的致病原因为抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的基因发生突变,使得功能性dystrophin蛋白缺失。目前,在临床上未见任何有效的治疗。反义寡核苷酸(Antisense Oligonucleotides-AO)介导的外显子跳读疗法是研究最为广泛的一种治疗方法,已经在III期临床试验。但最近的报道显示临床测试的药物系统运输效率低,临床试验结果未达到预期。因此,研发安全高效的药物运输辅助剂,以提高AO药物在全身肌肉中的运输效率,对于DMD的外显子跳读治疗乃至其他疾病的治疗显得尤为重要。针对这一关键科学问题,我们研发了一种新型药物运输辅助剂GF(2.5%glucose:2.5%fructose),在前期研究工作中发现:GF能显著促进mdx小鼠全身骨骼肌内反义寡核苷酸药物PMO的摄取及活性,但在心肌中未检测到dystrophin蛋白的表达。而心肌衰竭是限制DMD患者寿命的重要因素,是DMD治疗中需攻克的难题之一。为检测GF对mdx小鼠心肌和平滑肌的作用效果,本研究利用课题组前期研发的一系列能够在mdx小鼠体内发挥高效作用的肽修饰的PMO(Peptide-PMO,PPMO)类药物,在mdx小鼠上系统测试GF与不同肽-PMO在不同剂量下,对mdx小鼠心肌及平滑肌的作用。本研究分别测试了三类肽-PMO药物,包括R-PMO、Pip5e-PMO和B-MSP-PMO,这些AO药物能够高效诱导mdx心肌中dystrophin蛋白表达。通过将这三类药物分别与GF在mdx小鼠体内展开系统研究,旨在测试GF能否增强AO药物在mdx心肌和平滑肌中的运输效率。方法:1.药物注射途径和剂量:本研究通过小鼠尾静脉系统将生理盐水或GF辅助的反义寡核苷酸药物注射入6至8周龄的成年mdx小鼠体内,所有动物实验均为单次尾静脉注射。药物剂量分别为:12.5mg/kg R-PMO两周后收样、25mg/kg R-PMO三周后收样、15mg/kg Pip5e-PMO一周后收样、20mg/kg Pip5e-PMO两天以及20mg/kg B-MSP-PMO两周后收样,其中20mg/kg Pip5e-PMO为lissamine荧光标记药物。在B-MSP-PMO系统试验中,包含GF诱导组,通过每周一次单独注射GF,持续注射4周,第5周再注射GF和B-MSP-PMO药物。2.样品收取:治疗结束后,利用眼眶取血法获取小鼠血液样品,并通过静置离心获得血清。利用液氮冷冻收取小鼠心肌、前胫骨肌等6种骨骼肌;小肠等3种平滑肌以及脑组织。利用包氏液固定肝肾组织。***5e-PMO药物组织分布情况检测:利用小动物活体成像技术(IVIS)检测荧光染料标记的20mg/kg Pip5e-PMO在mdx小鼠各组织内的分布情况,并定量分析以确定GF对Pip5e-PMO组织摄取效率的影响。***检测:利用免疫组化荧光染色来检测不同药物引起的dystrophin蛋白阳性肌纤维在各组织切片内的分布和强度,以确定GF对不同药物的增强作用。***水平上的检测:利用RT-PCR技术来检测RNA水平上不同AOs药物引起的外显子23跳读水平,以确定GF对不同药物在RNA水平上的跳读提高作用。6.蛋白水平上的检测:利用Western Blot技术来检测不同药物在各组织内恢复的dystrophin蛋白表达水平,以确定GF对不同药物在蛋白水平上的促进作用。7.肌肉功能恢复情况检测:通过免疫组化荧光染色确定dystrophin蛋白相关复合物(DAPC)各蛋白成分在肌纤维膜上的重新定位情况和血清中CK-MB水平以评估心脏功能恢复情况;利用DAPC染色、血清中肌酸激酶CK含量测定、H&E染色统计骨骼肌中中心核纤维(centrally nucleated myofibers-CNF)比例、CD3和CD68组化染色确定胸膈肌中免疫炎症细胞数量以及抓力测试(grip strength)来评估骨骼肌功能改善程度。8.对B-MSP-PMO药物相关毒副作用检测:通过检测血糖水平,以确定药物注射对小鼠血糖浓度的影响;通过谷草转氨酶(AST)、肌酐(CREA)等血清学指标检测及H&E染色等方法评估药物潜在的毒副作用。结果:***5e-PMO组织分布检测:小动物活体成像检测和定量分析结果显示,GF未能有效促进荧光标记的Pip5e-PMO在mdx各肌肉组织中的摄取。2.新型运输辅助剂GF对三种不同AOs药物在骨骼肌中的IHC检测结果显示:1)在12.5mg/kg的剂量下,R-PMO和GF共注射在骨骼肌中恢复的dystrophin阳性肌纤维数量接近正常水平,二组无明显差异;同样,在25mg/kg剂量下,两个

关键词：杜兴肌肉萎缩症运输辅助剂GF 肽-PMO 外显子跳读抗肌萎缩蛋白

新型运输辅助剂F5及野生型小鼠在杜兴肌肉萎缩症中的应用研究

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新型运输辅助剂F5及野生型小鼠在杜兴肌肉萎缩症中的应用研究

作者：曹丽敏天津医科大学

学位级别：硕士

目的:杜兴肌肉萎缩症(Duchenne muscular dystrophy-DMD)是一种致死性的X染色体连锁遗传的神经肌肉失调症,目前临床未有任何有效的治疗方法。反义寡核苷酸介导的外显子跳读疗法成为杜兴肌肉萎缩症基因治疗中最有应用前景的方法之一,但最... 详细信息

目的:杜兴肌肉萎缩症(Duchenne muscular dystrophy-DMD)是一种致死性的X染色体连锁遗传的神经肌肉失调症,目前临床未有任何有效的治疗方法。反义寡核苷酸介导的外显子跳读疗法成为杜兴肌肉萎缩症基因治疗中最有应用前景的方法之一,但最近III期临床试验结果未能达到预期目标,究其根本原因是由于药物系统运输效率低所致。因此,亟需研发新型、高效的运输辅助剂,以提高反义寡核苷酸药物在肌肉中的系统运输效率。针对这一关键科学问题,前期工作中,我们在杜兴肌肉萎缩症小鼠模型测试了一系列新型运输辅助剂,发现F5表现出对反义寡核苷酸药物活性提高作用。本论文基于前期工作基础,在杜兴肌肉萎缩症小鼠模型上系统测试了包括F5在内的几种候选新型运输辅助剂对不同反义寡核苷酸药物活性增强作用,进而对效果最佳的F5展开全面、系统测试及安全性评估,预期为反义寡核苷酸药物的系统运输提供一种新途径和新策略,同时为新型运输辅助剂的临床应用提供重要实验依据和理论指导。另外,本论文还对其他潜在的杜兴肌肉萎缩症小鼠模型展开探索,以期为DMD反义寡核苷酸药物筛选及杜兴肌肉萎缩症治疗研究提供一种更容易获取和实用的小鼠模型,可进一步加速反义寡核苷酸药物及DMD新治疗方法研发进程。方法:1.基于前期筛选工作,将5种效果较优的候选辅助剂(F4、F5、F9、F10及F12)分别与5μg MOE在mdx小鼠的前胫骨肌上进行局部肌肉注射,两周后收取肌肉组织,利用IHC和RT-PCR分别检测dystrophin阳性肌纤维表达和分布及外显子跳读效率,通过定量分析以评估其作用效果。2.将上述5种辅助剂与5μg肽核酸(Peptide Nucleic Acid-PNA)在mdx小鼠上进行局部肌肉注射,两周后收取肌肉组织,利用IHC、RT-PCR及Western Blot在RNA及蛋白水平检测外显子跳读和dystrophin蛋白恢复表达情况,以评估辅助剂对PNA活性的增强作用;通过比较分析,以确认同种辅助剂对不同药物的作用效果,从而筛选出效果最佳的辅助剂。3.将优选辅助剂F5分别与不同反义寡核苷酸药物,包括2μg PMO,2μg M12-PMO,1μg B-MSP-PMO和2μg R-PMO,在mdx小鼠上进行局部肌肉注射,两周后收样,利用IHC、RT-PCR和Western Blot检测外显子跳读及dystrophin蛋白恢复表达情况,以探究F5对不同反义寡核苷酸药物的作用效果,从而确定F5与反义寡核苷酸药物的最佳组合。4.F5浓度效应研究,通过降低或提高F5浓度(F5A为2.5%;F5B为7.5%)与组合效果最优的PMO进行局部肌肉注射,两周后收样,利用上述检测方法在RNA和蛋白水平上,分别测试外显子跳读效率和dystrophin蛋白恢复表达情况,与F5(5%)比较,从而确定F5最佳使用浓度。5.为评估F5对PMO系统增强作用,将25 mg/kg的PMO通过尾静脉注射到成年mdx小鼠中,每周注射一次,连续注射3周,两周后收取全身肌肉组织及肝、肾脏等。利用与上述相同的检测方法,在RNA及蛋白水平上测试F5对PMO活性的增强作用,以评价F5对PMO的系统效果。同时利用组织免疫染色检测F5对肌肉和肝及肾脏是否造成潜在毒副作用。6.在前期研究中,我们发现新型运输辅助剂F9是通过提高反义寡核苷酸药物在组织中的摄取,而增强反义寡核苷酸药物的活性。为测试F5是否同样提高反义寡核苷酸药物在组织中的摄取而起作用,我们采用lissamine荧光标记PMO与F5在mdx小鼠上共注射。25 mg/kg lissamine标记的PMO与F5通过尾静脉注射到成年mdx小鼠中,每天注射一次,连续注射3天,四天后收取全身组织样品包括肌肉及肝、肾等非肌肉组织,通过小动物成像,检测各组织中lissamine荧光标记的PMO的荧光强度,以确定F5对PMO在mdx小鼠组织分布变化情况。同时利用上述提到的RT-PCR和Wetsern Blot方法,检测F5对PMO的作用效果。7.基于上述试验结果,在mdx小鼠模型上,系统测试F5对PMO的长期作用效果。将50 mg/kg的PMO与F5通过尾静脉注射方式,每周注射1次,连续注射3次;随后,每月注射1次,连续注射5次,最后一次注射后两周,收取全身组织包括肌肉及肝、肾等。利用IHC、RT-PCR和Western Blot在RNA及蛋白水平上检测PMO介导外显子跳读和dystrophin蛋白恢复表达情况;同时通过抓力测试、dystrophin蛋白复合物、血清中肌酸激酶、天冬氨酸转移酶等指标检测及组化染色等方法,系统评估F5对PMO的增强效果和对mdx小鼠功能改善情况及潜在的毒副作用,以确定F5对反义寡核苷酸药物PMO的长期作用效果。8.为测试野生型小鼠作为杜兴肌肉萎缩症模型的可行

关键词：杜兴肌肉萎缩症运输辅助剂反义寡核苷酸外显子跳读野生型小鼠动物模型

维生素在杜兴肌肉萎缩症反义寡核苷酸介导的外显子跳读治疗中的作用研究

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维生素在杜兴肌肉萎缩症反义寡核苷酸介导的外显子跳读治疗中的作...

作者：宋军天津医科大学

学位级别：硕士

杜兴肌肉萎缩症（Duchenne Muscular Dystrophy,DMD）是一种伴X染色体遗传的致死性肌肉萎缩症。反义寡核苷酸药物介导的外显子跳读疗法是目前最具潜力的治疗方法之一,但存在药物运输效率低问题。近年来,小分子化合物作为反义寡核苷酸药... 详细信息

杜兴肌肉萎缩症（Duchenne Muscular Dystrophy,DMD）是一种伴X染色体遗传的致死性肌肉萎缩症。反义寡核苷酸药物介导的外显子跳读疗法是目前最具潜力的治疗方法之一,但存在药物运输效率低问题。近年来,小分子化合物作为反义寡核苷酸药物辅剂,可增强药物在肌肉中的活性,从而受广泛关注,但对DMD心脏功能改善比较有限。而维生素类化合物可改善DMD小鼠肌肉功能,显示出作为临床辅剂的应用潜力。基于此,在本研究中,我们在DMD小鼠（mdx）模型上,测试B族维生素及其衍生物对反义寡核苷酸药物PMO的增强效果。在局部肌肉注射结果发现:与单独PMO治疗组相比,维生素B12和B3均能显著地增强PMO介导dystrophin蛋白的表达能力。然而,在mdx小鼠进行系统测试结果显示:维生素B12对PMO活性增强效果不明显。鉴于烟酰胺核糖（Nicotinamide riboside,NR）可促进肌肉干细胞增殖,而肌肉干细胞增殖分化会促进核酸药物摄取。在本研究中,首先检测NR在dys/utr小鼠模型上对PMO的促进效果,结果显示:与单独PMO治疗组相比,NR能显著提高PMO局部的治疗效果,并且在系统测试中腹壁肌和股四头肌促进效果最为显著,同时有效的促进PMO对小鼠运动能力的提高和膈肌心肌病理状态的改善。基于NR和PMO系统治疗改善心肌病理却不能有效的促进dystrophin在心肌的表达,我们提高PMO系统治疗用量进行测试,结果显示:小鼠心肌组织中dystrophin仍未表达,但骨骼肌中NR对PMO介导的治疗效果依旧显著。为验证NR单独使用对心肌产生的潜在治疗作用,我们使用单独NR对d KO系统治疗,结果显示:NR能显著抑制小鼠的体重消减,提高肌肉功能,改善心肌的病理以及心脏功能。最后为验证NR发挥作用的机制,将单独NR对dys/utr小鼠进行治疗,结果显示:NR能显著的提高dys/utr小鼠肌肉肌卫星细胞和新生肌纤维的数量。因此本研究得出结论:NR通过调控肌卫星细胞增殖和肌肉再生进而即可以促进PMO摄取,提高外显子跳读疗法的治疗效果;又可以通过组织再生缓解肌肉消减,维持心肌和骨骼肌的正常功能,这充分显示NR在杜兴肌肉萎缩症反义寡核苷酸介导的外显子跳读治疗中的应用潜力。

关键词：杜兴肌肉萎缩症外显子跳读疗法 B族维生素烟酰胺核糖组织再生