肌肉细胞来源exosome的分析鉴定及在杜兴肌肉萎缩症小鼠模型上的初步研究

作     者：牛鸿婧 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：尹海芳

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：Exosome 超速离心 杜兴肌肉萎缩症 蔗糖密度梯度离心 电击转化 

摘      要：目的:Exosome是一种大小在40-100 nm之间的囊泡状膜结构,不同细胞来源的exosome含有不同的蛋白和RNA成分。Exosome在抗原呈递、细胞间信息传递和运输等过程中起着重要的作用。由于exosome能够获取源细胞中的多种蛋白或RNA（mRNA和microRNA）,并进行细胞间传递,是细胞内信使及内源性蛋白和RNA的运输载体。因此我们在前期工作中,利用小鼠未成熟树突状细胞来源的exosome作为运输载体,来尝试运输外源siRNA药物。通过对exosome特异性靶向修饰,赋予其靶向脑神经的能力,从而成功地将siRNA运输到脑神经中,介导特异性靶基因下调,证明exosome可以作为外源基因的运输载体。因此在本论文中,我们尝试利用exosome运输反义寡核苷酸药物,并以杜兴肌肉萎缩症（DMD）作为疾病测试模型评估exosome作为反义寡核苷酸药物载体的能力和潜力。DMD是由dystrophin基因突变导致的dystrophin蛋白缺失所引发的一种致死性神经肌肉失调症,到目前为止,临床上未有任何有效的治疗方法。反义寡核苷酸介导的外显子跳读的治疗方法是最有应用前景的治疗方法之一,已处于临床Ⅲ期试验,结果喜人。然而临床上测试的反义寡核苷酸药物存在系统运输效率低的问题,本研究拟以exosome作为反义寡核苷酸药物的运输载体,以期提高反义寡核苷酸药物在肌肉中的系统运输效率。方法:***的制备：利用多步超速离心法。首先通过1000 g,15 mins离心去除细胞碎片;取上清,利用12,000 g,20 mins离心后,再用0.22 μm滤膜过滤,去除杂质;收集上清,通过100,000 g,超速离心70 mins,用PBS重悬沉淀,获得 exosome。***的生化鉴定:利用exosome的标志性蛋白Alix和TSG101,通过Western Blot来检测exosome的存在;为确定无细胞碎片的污染,使用细胞器线粒体中的蛋白Cytochrome C作为检测指标。***的形态鉴定:利用透射电子显微镜观察exosome形态特征。将醋酸铵重悬的exosome滴加到附有碳膜的铜网上5 mins,弃去剩余液体后自然干燥。滴加1%磷钨酸染液2 mins,弃去染液,干燥后用透射电镜观察。***的密度确认:利用蔗糖梯度离心的方法,检测exosome的密度。制备1.07-1.25 g/mL的蔗糖密度梯度溶液,按密度由大到小依次加入到超速离心管,在最上层加入一定量exosome悬浮液,经100,000 g,16 h超速离心,分别收集每一密度梯度层的蔗糖溶液,并将其中的exosome沉淀、分离,用PBS重悬定量。***进入源细胞的能力测试:使用膜特异标记染料PKH67对肌肉细胞来源的exosome进行标记,并加入到肌肉细胞C2C12中,在不同时间点观察其进入细胞情况,确定exosome进入其源细胞的最佳时间点。***在细胞内的定位:将PKH67标记的exosome加入肌肉细胞,利用细胞器例如溶酶体特异标记染料和早期内体（Early Endosome）特异标记染料,来检测exosome在细胞内的位置。***的细胞或组织趋向性分析:检测PKH67标记的exosome进入不同细胞包括肌肉细胞、脂肪前体细胞及成纤维细胞的能力。通过荧光显微镜和流式细胞分析确定肌肉细胞来源的exosome的细胞趋向性;并检测荧光标记exosome在mdx小鼠中各组织中的分布情况,以确定肌肉细胞来源的exosome是否具有肌肉趋向性。***运输反义寡核苷酸药物的体外检测:通过电击转化的方法将反义寡核苷酸装载入exosome,并在DMD细胞模型中检测其运输反义寡核苷酸药物的效率。***运输反义寡核苷酸药物的体内局部检测:将装载反义寡核苷酸的exosome通过肌肉局部注射,注射到mdx小鼠前径骨肌中,两周后取样检测。通过免疫组织化学染色法和RT-PCR检测模型小鼠肌肉纤维的恢复情况及外显子跳读的效率。结果:1.通过多步离心法,从细胞的培养上清中提取到exosome,并通过蛋白定量的方法,确定每毫升细胞培养上清可提取5 μg exosome。2.通过Western Blot方法,利用exosome标志性蛋白Alix和TSG101,确定获得了肌肉细胞来源的exosome;同时通过检测细胞器上的特征性蛋白Cytochrome C,来证实所提取的exosome中无细胞碎片污染。3.通过蔗糖密度梯度离心的方法来纯化exosome,获得的exosome密度与报道一致。Western Blot实验结果确认,蔗糖梯度纯化的exosome悬浮在蔗糖密度梯度为1.13-1.19 g/mL之间,与报道的