2’-0-甲氧乙基反义寡核苷酸在杜兴肌肉萎缩症上的应用研究

作     者：杨璐 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：尹海芳

授予年度：2012年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：杜兴肌肉萎缩症 反义寡核苷酸 外显子跳读 抗肌萎缩蛋白 甲氧乙基 

摘      要：目的： 杜兴肌肉萎缩症是一种由dystrophin基因突变,导致dystrophin蛋白缺失所引发的致死性神经肌肉失调症,本研究利用杜兴肌肉萎缩症疾病细胞和动物模型来测试一种新的反义寡核苷酸化学结构-2’-O-甲氧乙基(2’-O-MOE),通过对该反义寡核苷酸化学结构的体外、体内局部和系统的测试,其中包括系统给药剂量和给药途径的优化,预期为杜兴肌肉萎缩症反义寡核苷酸介导的外显子跳读的基因治疗方法提供一种候选的反义寡核苷酸药物。与此同时,通过对荧光标记的2’-O-MOE反义寡核苷酸药物体外和体内试验,来测试该反义寡核苷酸药物在肌肉细胞内的定位和摄取效率及在实验动物各组织内的分布情况。 方法： 1.浓度效应试验中将300nM、500nM、1μM不同长度和骨架修饰的2’-O-MOE包括MOE20(PS).MOE25(PS)和MOE25(PO)反义寡核苷酸药物通过脂质体转染H?K mdx细胞48h后,利用RT-PCR技术检测其诱导外显子23跳读的效率。 2.时间效应试验中将500nM不同长度和骨架修饰的2’-O-MOE反义寡核苷酸药物通过脂质体转染H2K mdx细胞24h、48h、72h、96h后,利用RT-PCR技术检测其诱导外显子23跳读的效率。 3.细胞毒性试验中,应用WST试剂盒分别检测高于试验测试浓度5倍和10倍的MOE25(PS)、MOE25(PO)和MOE20(PS)对细胞增殖能力和生存率的影响。 4.不同反义寡核苷酸化学结构比较试验中,将500nM MOE25(PS)、 MOE25(PO).MOE20(PS)和2’OmePS通过脂质体转染H2K mdx细胞48h后,利用RT-PCR技术检测不同反义寡核苷酸药物诱导外显子23跳读效率的差异。 5.在mdx小鼠局部肌肉试验中.将5μg的MOE25(PS)、MOE25(PO)、MOE20(PS)和2’OmePS分别注射到成年mdx小鼠的胫前肌(tibialis anterior-TA)。注射两周后,收集肌肉组织样品。利用免疫组化、RT-PCR和Western Blot测试各反义寡核苷酸药物诱导外显子23跳读效率和dystrophin蛋白的分布及表达水平。 6.将局部肌肉测试效果较好的2’-O-MOE反义寡核苷酸通过尾静脉、腹腔和皮下注射等不同给药途径及不同的剂量进行系统测试,注射2周后,收取全身肌肉组织包括胸膈肌和心肌,利用免疫组化、RT-PCR和Western blot方法系统检测该反义寡核苷酸诱导外显子跳读和dystrophin蛋白表达的效率。 7.在动物体内组织分布试验中,将100mg/kg荧光标记的MOE25(PS)通过尾静脉隔天注射成年mdx小鼠,连续给药5次,检测该MOE25(PS)在mdx小鼠各肌肉组织中的分布情况。 8.在细胞摄取试验中,将荧光标记的MOE25(PS)通过脂质体转染H2K mdx细胞后,通过荧光显微镜检测不同时间点细胞对荧光标记MOE25(PS)的摄取情况,并利用流式细胞仪定量分析H2K mdx细胞对其摄取情况。 9.在细胞内定位试验中,将荧光标记的MOE25(PS)通过脂质体转染H2K mdx细胞4h后,通过激光扫描共聚焦荧光显微镜检测MOE(PS)在H2K mdx细胞中的定位情况,包括与细胞核和溶酶体等细胞器的共定位情况。 结果： 1.在浓度效应试验中,结果表明：随着浓度的升高,3种不同2’-O-MOE反义寡核苷酸药物诱导H2K mdx细胞外显子跳读的效率也随之增加,表现出浓度依赖性效应。其中以MOE25(PS)诱导外显子23跳读效果最佳,在500nM时,已达到90%以上外显子跳读效率。 2.细胞毒性分析试验结果显示MOE25(PS)和MOE20(PS)在10μM的浓度下对细胞的增殖和生存率无影响,而MOE25(PO)在该浓度表现出对细胞轻微的毒害作用。 3.在时间效应试验中,RT-PCR结果显示：MOE25(PO)和MOE25(PS)诱导H2Kmdx细胞外显子23跳读效率最高的时间点都为转染后48h。 4.不同反义寡核苷酸化学结构比较试验中,在500nM浓度时,：RT-PCR结果显示：MOE25(PS)诱导外显子23跳读的效率显著高于2’OmePS和MOE20(PS),略高于MOE25(PO),表明MOE25(PS)是一种比2’OmePS更有效的反义寡核苷酸药物。 5.在mdx小鼠的局部肌肉注射试验中,结果表明：四种测试反义寡核苷酸都能够有效地诱导dystrophin蛋白在mdx小鼠胫前肌中的表达,其中尤为突出的是MOE25(PS),能够有效诱导dystrophin蛋白在整个肌肉组织切片上均匀分布和表达,且Western blot结果显示在MOE25(PS)处理的胫前肌中dystrophin蛋白的表达量接近于正常组织中的30%,与其他三种