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流感病毒M2蛋白胞外区与铜绿假单胞菌外毒素a融合蛋白的表达及其免疫原性研究

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病毒学报 2010年第3期26卷 189-194页

作者：徐一姚立红陈爱珺郭建强刘晓宇薄洪刘丽琦舒跃龙张智清中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室北京100052 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室国家流感中心北京100052

本研究构建了表达甲型流感病毒M2蛋白胞外区与铜绿假单胞菌外毒素a(PEA)融合蛋白的原核表达载体,根据铜绿假单胞菌外毒素a(PEA)核苷酸序列设计突变PCR引物并实施突变PCR,以获得PEA基因编码区第553位氨基酸密码子缺失的突变PEA(ntPE),从... 详细信息

本研究构建了表达甲型流感病毒M2蛋白胞外区与铜绿假单胞菌外毒素a(PEA)融合蛋白的原核表达载体,根据铜绿假单胞菌外毒素a(PEA)核苷酸序列设计突变PCR引物并实施突变PCR,以获得PEA基因编码区第553位氨基酸密码子缺失的突变PEA(ntPE),从而产生无毒性的PEA突变基因,然后用合成的M2e编码区替换ntPE基因中的非必需区Ib,产生ntPE-M2e嵌合基因。将该嵌合基因导入pET表达载体以构建原核表达载体,将表达产物胶回收后与弗氏不完全佐剂联合皮下免疫BALB/c小鼠,终免两周后用5个LD50流感病毒A/PR/34/8株进行攻击。取动物血清作ELISA并取脾脏作ELISPOT试验结果表明,免疫组可以诱导小鼠产生抗M2e特异性抗体反应和细胞免疫反应并能够抑制病毒在肺内的复制。本研究为甲型流感病毒广谱疫苗的进一步研发打下了基础。

关键词：甲型流感病毒M2e 铜绿假单胞菌外毒素a 免疫原性

大肠杆菌O157∶H7多糖-重组铜绿假单胞菌外毒素a结合疫苗的研制

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中华微生物学和免疫学杂志 2004年第11期24卷 905-909页

作者：王燕吴朝今杜送田蒋奕雍元李岷松赵志强蒋仁生杜琳谢贵林兰州生物制品研究所 730046

目的　用大肠杆菌O15 7∶H7(EscherichiacoliO15 7∶H7,E .coliO15 7)的一个重要保护性抗原即菌体脂多糖 (LPS)制备有效的候选疫苗。方法　选用Westphal热酚法提纯E .coliO15 7∶H7的LPS ,经酸水解法进一步脱毒处理后得到无毒但却具弱... 详细信息

目的　用大肠杆菌O15 7∶H7(EscherichiacoliO15 7∶H7,E .coliO15 7)的一个重要保护性抗原即菌体脂多糖 (LPS)制备有效的候选疫苗。方法　选用Westphal热酚法提纯E .coliO15 7∶H7的LPS ,经酸水解法进一步脱毒处理后得到无毒但却具弱免疫原性的O 特异性多糖 (O SP) ,然后采用己二酸二肼 (ADH)将其共价结合到琥珀酰化 (或没琥珀酰化 )重组铜绿假单胞菌外毒素 (rEPAsucc或rE PA)上。结果　制备得到的E .coliO15 7∶H7的O SP rEPAsucc或O SP rEPA结合疫苗是安全有效的 ,其免疫原性要比单一O SP的免疫原性强 ,免疫小鼠后产生的血清抗LPSIgG抗体滴度比单一O SP免疫后产生的抗体水平均有显著性升高 (P <0 .0 1) ,且再次注射后存在加强应答。结论　E .coliO15 7∶H7的O SP rEPAsucc结合疫苗可望作为一种预防肠出血性E .

关键词：结合疫苗大肠杆菌O157:H7 铜绿假单胞菌 LPS E.coli 外毒素a 多糖 EPA 共价结合 ADH

铜绿假单胞菌外毒素a的表达、纯化与生物学活性研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2007年第3期27卷 229-233页

作者：胡晓梅胡福泉申晓冬黄建军饶贤才丛延广李明周莹冰但芸婕第三军医大学基础部微生物学教研室重庆400038

目的利用基因工程技术制备铜绿假单胞菌外毒素a（PE），为深入研究PE的致病机理和免疫防治奠定基础。方法应用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增外毒素a全长结构基因，将其克隆于原核表达载体pQE-31中，所构建的重组质粒经测序鉴定后... 详细信息

目的利用基因工程技术制备铜绿假单胞菌外毒素a（PE），为深入研究PE的致病机理和免疫防治奠定基础。方法应用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增外毒素a全长结构基因，将其克隆于原核表达载体pQE-31中，所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109，IPTG诱导表达；制备融合蛋白包涵体，并采用Ni—NTA柱亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析分离和纯化目的蛋白；采用透析法对纯化后的目的蛋白进行复性，MTT法测定复性后的重组PE对L929细胞、B16黑素瘤细胞的细胞毒活性。结果通过对PCR反应体系的优化，扩增到了PE全长结构基因。所构建的pQE-PE重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致；转化*** JM109后，IFTG诱导目的蛋白表达率约为25％；SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量（Mr）约为66×10^3，与理论预期值一致；破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达。经亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析后蛋白纯度大于95％。MTT法测得重组PE对L929细胞和B16黑素瘤细胞的半数抑制浓度（IC50值）分别为2．13μg/ml、2．58μg/ml。结论通过对PE的表达纯化，获得了具有细胞毒活性的重组PE，为利用基因工程手段大量制备PE的工作奠定了基础。

关键词：铜绿假单胞菌外毒素a 克隆表达蛋白纯化细胞毒活性

绿脓杆菌外毒素a的细胞毒性和细胞表面受体密度

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中国药理学与毒理学杂志 1992年第4期6卷 289-291页

作者：杨理邦庄汉澜军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071

用微量细胞法观察了肝癌细胞SMMC-7721,成纤维细胞L929。肺癌细胞A549及中国地鼠卵巢细胞CHOk1等4株传代细胞对绿脓杆菌外毒素a细胞毒作用的敏感性,结果SMMC-7721最敏感,L929次之,A549次于前两者,CHOk1最次,用ELISA法显示各细胞株表面... 详细信息

用微量细胞法观察了肝癌细胞SMMC-7721,成纤维细胞L929。肺癌细胞A549及中国地鼠卵巢细胞CHOk1等4株传代细胞对绿脓杆菌外毒素a细胞毒作用的敏感性,结果SMMC-7721最敏感,L929次之,A549次于前两者,CHOk1最次,用ELISA法显示各细胞株表面绿脓杆菌外毒素a受体,且用图像分析比较受体密度,结果与细胞毒作用一致,以SMMC-7721为最高,显示了细胞毒敏感程度与受体量呈正相关。

关键词：绿脓杆菌受体外毒素a

重组铜绿假单胞菌外毒素a的原核表达和多克隆抗体制备及免疫保护功能分析

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湖南农业大学学报（自然科学版） 2016年第1期42卷 33-38页

作者：刘祥陕西理工学院生物科学与工程学院陕西汉中723001

为探索铜绿假单胞菌ETA蛋白的免疫保护功能,采用分子克隆方法获得铜绿假单胞菌ETA表达菌株;利用切胶纯化获得ETA蛋白并免疫小鼠,制备ETA蛋白多克隆抗体;用ELISA方法,检测出ETA抗血清滴度达1∶8 000;蛋白质印迹分析结果表明,抗血清具有... 详细信息

为探索铜绿假单胞菌ETA蛋白的免疫保护功能,采用分子克隆方法获得铜绿假单胞菌ETA表达菌株;利用切胶纯化获得ETA蛋白并免疫小鼠,制备ETA蛋白多克隆抗体;用ELISA方法,检测出ETA抗血清滴度达1∶8 000;蛋白质印迹分析结果表明,抗血清具有很好的特异性;小鼠免疫保护试验结果表明,ETA对铜绿假单胞菌感染的保护率达50%,显著高于对照组的免疫保护率。用DNAman软件对ETA序列同源性进行分析,发现革兰氏阴性菌的同源性高于革兰氏阳性菌,铜绿假单胞菌种间的同源性高于其他种类细菌的同源性;用MEGA软件对ETA的进化分析结果表明,不同血清型铜绿假单胞菌的亲缘关系高于其他细菌,据此可推测ETA免疫动物产生的特异性抗体可能为不同种类铜绿假单胞菌的感染提供交叉免疫保护。

关键词：铜绿假单胞菌外毒素a 原核表达多克隆抗体酶联免疫法免疫保护

采用PCR技术从高GC含量绿脓杆菌模板中扩增长片段外毒素a全基因

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第三军医大学学报 2003年第9期25卷 833-834页

作者：胡晓梅饶贤才黄建军金晓琳朱军民胡福泉第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程重点实验室重庆400038

从高GC含量的模板中用PCR方法扩增长片段DNA序列是相当困难的。本室通过对PCR反应体系和条件的优化，成功地从绿脓杆菌高GC含量的染色体模板中扩增到了1 966 bp的外毒素a（Pseudomoneas aeruginosa exotoxin A, PEA）全长结构基因，为实... 详细信息

从高GC含量的模板中用PCR方法扩增长片段DNA序列是相当困难的。本室通过对PCR反应体系和条件的优化，成功地从绿脓杆菌高GC含量的染色体模板中扩增到了1 966 bp的外毒素a（Pseudomoneas aeruginosa exotoxin A, PEA）全长结构基因，为实现PEA的高效表达奠定了基础。

关键词： PCR技术高GC含量绿脓杆菌模板 DNA 外毒素a PCR扩增长片段基因

重组绿脓杆菌外毒素a受体结合区蛋白的初步复性及细胞生物学活性检测

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中国兽医学报 1998年第5期18卷 469-472页

作者：刘晓明马丛林郭学军朱平王瑾琪甄英凯解放军农牧大学军事兽医研究所

用逐步稀释透析法将纯化的大肠杆菌表达的重组绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）受体结合区蛋白初步复性，复性后的可溶性蛋白用于竞争抑制ＰＥＡ的细胞毒性实验。将１０μｇ／Ｌ的ＰＥＡ与其敏感细胞Ｌ９２９共孵育，３６ｈ左右可见细胞发生... 详细信息

用逐步稀释透析法将纯化的大肠杆菌表达的重组绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）受体结合区蛋白初步复性，复性后的可溶性蛋白用于竞争抑制ＰＥＡ的细胞毒性实验。将１０μｇ／Ｌ的ＰＥＡ与其敏感细胞Ｌ９２９共孵育，３６ｈ左右可见细胞发生病变死亡，而同时加入复性的重组ＰＥＡ受体结合区蛋白的培养细胞孔与未加ＰＥＡ阴性对照培养细胞一样仍分裂增殖，这种ＰＥＡ细胞毒性抑制作用可持续到所有培养细胞老化死亡。结果表明，重组ＰＥＡ受体结合区蛋白可在体外竞争抑制ＰＥＡ对Ｌ９２９细胞的毒性。

关键词：绿脓杆菌外毒素a 细胞毒性竞争抑制

绿脓杆菌外毒素a的Ⅰ+Ⅱ区基因的克隆与表达

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中华微生物学和免疫学杂志 1996年第2期16卷 139-142页

作者：何菱胡福泉逯好英沈定霞俞树荣马贤凯第三军医大学微生物学教研室重庆630038 军事医学科学院基础所分子遗传室

绿脓杆菌外表素Ａ是由６１３个氨基酸残基组成的单链杀细胞毒素；利用ＰＣＲ技术直接从绿脓杆菌染色体ＤＮＡ中扩增了外毒素Ａ的Ⅰ＋Ⅱ区的结构基因，通过酶切鉴定、ＤＮＡ序列分析，证实了克隆的基因片段为外毒素Ａ的结构基因；重组表... 详细信息

绿脓杆菌外表素Ａ是由６１３个氨基酸残基组成的单链杀细胞毒素；利用ＰＣＲ技术直接从绿脓杆菌染色体ＤＮＡ中扩增了外毒素Ａ的Ⅰ＋Ⅱ区的结构基因，通过酶切鉴定、ＤＮＡ序列分析，证实了克隆的基因片段为外毒素Ａ的结构基因；重组表达质粒经诱导表达后ＳＤＳ－ｐＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实了表达的产物为外毒素Ａ分子。对外毒素Ａ的Ⅰ＋Ⅱ区结构基因的克隆表达为疫苗研制、毒素类似物的制备以及导向药物的构建打下了基础。

关键词：绿脓杆菌外毒素a 基因克隆基因表达

铜绿假单胞菌外毒素a表达载体的构建及可溶性表达

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解放军医学杂志 2004年第2期29卷 156-158页

作者：胡晓梅饶贤才黄建军金晓琳胡福泉第三军医大学微生物学教研室重庆400038

目的　实现铜绿假单胞菌外毒素a(PEA)全基因的可溶性表达。方法　用基因重组技术构建pMAL PEA原核分泌型表达载体 ,并在大肠杆菌BL2 1中进行表达 ,然后利用直链淀粉树脂对表达蛋白进行亲和层析纯化。结果　酶切鉴定及测序结果表明pMAL ... 详细信息

目的　实现铜绿假单胞菌外毒素a(PEA)全基因的可溶性表达。方法　用基因重组技术构建pMAL PEA原核分泌型表达载体 ,并在大肠杆菌BL2 1中进行表达 ,然后利用直链淀粉树脂对表达蛋白进行亲和层析纯化。结果　酶切鉴定及测序结果表明pMAL P2X载体上成功地插入了PEA全基因。用IPTG诱导目的基因表达 ,表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的 2 0 %。表达产物经超声处理后 ,80 %的融合蛋白存在于上清液中 ,说明实现了PEA的可溶性表达。表达的融合蛋白经亲和层析纯化后进行SDS PAGE电泳 ,显示为一条蛋白带 ,分子量约为 112kD。结论　成功地对PEA全基因进行了可溶性表达和纯化 ,获得了稳定表达的工程菌 ,为深入研究PEA的致病机制和制备用于免疫导向治疗的重组毒素奠定了基础。

关键词：铜绿假单胞菌外毒素a 重组质粒基因表达