铜绿假单胞菌外毒素A的表达、纯化与生物学活性研究

作     者：胡晓梅 胡福泉 申晓冬 黄建军 饶贤才 丛延广 李明 周莹冰 但芸婕 HU Xiao-mei;HU Fu-quan;SHEN Xiao-dong;HUANG Jian-jun;RAO Xian-cai;CONG Yan-guang;LI Ming;ZHOU Ying-bing;DAN Yun-jie

作者机构：第三军医大学基础部微生物学教研室重庆400038 

出 版 物：《中华微生物学和免疫学杂志》 (Chinese Journal of Microbiology and Immunology)

年 卷 期：2007年第27卷第3期

页      面：229-233页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

基　　金：全军医学科研十五计划青年基金课题(01Q108) 国家自然科学基金(30572158) 重庆市自然科学基金(CSTC-2005BB5294) 

主　　题：铜绿假单胞菌 外毒素A 克隆表达 蛋白纯化 细胞毒活性 

摘      要：目的利用基因工程技术制备铜绿假单胞菌外毒素A（PE），为深入研究PE的致病机理和免疫防治奠定基础。方法应用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增外毒素A全长结构基因，将其克隆于原核表达载体pQE-31中，所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109，IPTG诱导表达；制备融合蛋白包涵体，并采用Ni—NTA柱亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析分离和纯化目的蛋白；采用透析法对纯化后的目的蛋白进行复性，MTT法测定复性后的重组PE对L929细胞、B16黑素瘤细胞的细胞毒活性。结果通过对PCR反应体系的优化，扩增到了PE全长结构基因。所构建的pQE-PE重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致；转化*** JM109后，IFTG诱导目的蛋白表达率约为25％；SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量（Mr）约为66×10^3，与理论预期值一致；破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达。经亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析后蛋白纯度大于95％。MTT法测得重组PE对L929细胞和B16黑素瘤细胞的半数抑制浓度（IC50值）分别为2．13μg/ml、2．58μg/ml。结论通过对PE的表达纯化，获得了具有细胞毒活性的重组PE，为利用基因工程手段大量制备PE的工作奠定了基础。