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利用CRISPR/Cas9n double nick系统构建人DNAH2基因敲除的U2OS细胞株

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生物工程学报 2017年第2期33卷 284-293页

作者：常丽贤孙聪聪陈晓娟杨文钰张家源张英弛袁卫平竺晓凡中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所天津300020

基于CRISPR/Cas9n double nick技术构建人DNAH2(Homo sapiens dynein,axonemal,heavy chain 2)基因敲除的U2OS稳定细胞株,旨在研究DNAH2基因的生物学功能。首先设计并合成A、B两个sg RNA(Single guide RNA)以及各自的互补链,退火连接形成DNAH2 sg RNA-A、B双链,再分别与带有BbsⅠ粘性末端的p X462线性载体相连,形成p X462-DNAH2-A、p X462-DNAH2-B重组真核表达质粒。质粒共转染至U2OS细胞后,加入嘌呤霉素,以有限稀释法获得阳性单克隆细胞株,再以蛋白印迹实验检测DNAH2蛋白的表达,最后通过PCR-基因测序技术分析突变特点。结果显示A、B sg RNA双链成功插入p X462载体,U2OS-DNAH2-KO单克隆细胞株中DNAH2蛋白不表达,DNAH2基因发生移码突变,从而证实利用CRISPR/Cas9n double nick系统成功构建人DNAH2基因敲除的U2OS稳定细胞株,为研究DNAH2基因提供有利工具。

关键词： DNAH2 CRISPR/Cas9n 基因敲除稳定细胞株

新型酵母蛋白表位标记和基因敲除质粒系统的构建及可行性验证

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微生物学报 2019年第5期59卷 939-949页

作者：唐仕伟李辉崔时媛张正坦谢志平上海交通大学生命科学技术学院上海200240

【目的】构建一套用于酿酒酵母基因功能研究的质粒。该套质粒结合pUG系列和pFA6a系列的优点,同时采用同尾酶实现蛋白表位标签的串联插入。【方法】利用PCR技术分别克隆pUG系列质粒的lox P位点、pFA6a质粒多酶切位点和ADH1终止子模块;通... 详细信息

【目的】构建一套用于酿酒酵母基因功能研究的质粒。该套质粒结合pUG系列和pFA6a系列的优点,同时采用同尾酶实现蛋白表位标签的串联插入。【方法】利用PCR技术分别克隆pUG系列质粒的lox P位点、pFA6a质粒多酶切位点和ADH1终止子模块;通过重组连接各片段,构建pCLHN-TRP和pCLHN-URA质粒。在此基础上利用同尾酶实现多种蛋白表位标签的单个或串联重复插入,获得一系列蛋白表位标记质粒。最后,以ATG1、COX4和NHX1为例验证本质粒系列的性能。【结果】在本项工作中,我们共构建2种基因敲除用质粒和17种表位标记用质粒(涵盖1-8 FLAG、1-12 V5、3-9 HA、2-8MYC、GFP和m Cherry)。在几个靶基因上的应用证实了本套质粒的实用性。尤其值得指出的是,通过组合采用不同重复度的串联表位标签,在同一张膜上同时检测表达差异极大的不同蛋白而不使高表达蛋白信号饱和成为可能。【结论】本文所构建的pCLHN质粒系列是对现有酵母质粒工具的有益补充。

关键词：酵母细胞基因敲除蛋白标签同尾酶表达量

一种强力霉素诱导型白念珠菌基因敲除与筛选标记再循环工具包（英文）

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微生物学报 2019年第1期59卷 68-78页

作者：常鹏尹华王文娟陈江野西南大学资源环境学院生物能源与环境修复研究中心重庆400715 中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所上海200031

【目的】在白念珠菌中建立一个快捷方便经济的基因敲除与筛选标记再循环的DNA操作系统。【方法】通过ExoIII介导的不依赖于连接酶的克隆策略,在异源筛选标记基因CmLEU2、CdHIS1和CdARG4基因的两侧分别插入了loxP位点,成为筛选标记基因... 详细信息

【目的】在白念珠菌中建立一个快捷方便经济的基因敲除与筛选标记再循环的DNA操作系统。【方法】通过ExoIII介导的不依赖于连接酶的克隆策略,在异源筛选标记基因CmLEU2、CdHIS1和CdARG4基因的两侧分别插入了loxP位点,成为筛选标记基因盒扩增的模板。全基因合成了经过白念珠菌密码子优化的rTetR元件,并组装成Tet-on启动子。将密码子优化的重组酶Cre基因置于该启动子控制下。然后将他们插入筛选标记基因CdHIS1和CdARG4的CDS区域,形成筛选标记基因再循环载体。【结果】构建了3个用于白念珠菌基因敲除的侧翼含有loxP位点的筛选标记基因载体,以及2个含有Tet-on启动子控制的Cre酶的载体用于筛选标记基因的再循环。【结论】成功构建了一个白念珠菌中可诱导的基因敲除和筛选标记再循环的载体系统并成功应用于多个基因缺失株构建。这个系统有助于快速构建白念珠菌的单基因和多基因敲除菌株。

关键词：白念珠菌基因敲除 Tet-on 筛选标记再循环 Cre loxP

POLQ基因敲除293T细胞系的构建及其在外源基因定点整合中的应用

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中国生物工程杂志 2024年第5期44卷 40-55页

作者：王瑶姜志洋蔡军雨樊榕榕贾姗姗冯健男石艳春王晶郑源强内蒙古医科大学内蒙古自治区分子生物学重点实验室呼和浩特010058 军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所国家安全特需药品全国重点实验室北京100850

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建POLQ基因敲除293T细胞系,并探讨该敲除细胞系在外源基因定点整合方面的应用。方法:构建靶向POLQ基因的pX330-sgRNA打靶载体,通过T7EI酶切验证,选取打靶效率最高的载体,转染293T细胞;利用流式细胞分选术、... 详细信息

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建POLQ基因敲除293T细胞系,并探讨该敲除细胞系在外源基因定点整合方面的应用。方法:构建靶向POLQ基因的pX330-sgRNA打靶载体,通过T7EI酶切验证,选取打靶效率最高的载体,转染293T细胞;利用流式细胞分选术、稳定单细胞克隆培养、TA克隆测序及蛋白质印迹等方法验证POLQ敲除情况;利用靶向AAVS1和FBL位点的含GFP/mCherry报告基因同源打靶载体,评估敲除的293T POLQ-/-细胞系在外源基因定点整合效率的变化,并通过测序方式验证供体报告载体是否定点整合到基因组中;最后分析POLQ敲除对293T细胞增殖和存活率的影响。结果:成功在293T细胞中稳定敲除POLQ基因;通过报告基因实验验证,敲除细胞系中外源基因定点整合效率平均提高2~7倍,且敲除POLQ基因对293T细胞系增殖和存活率没有明显影响。结论:成功利用CRISPR/Cas9技术构建具有高效定点整合能力的POLQ基因稳定敲除293T细胞系,为进一步利用该细胞系高效制备稳定整合外源基因(包括抗体基因)工程化细胞系奠定基础。

关键词： CRISPR/Cas9 POLQ 293T细胞基因敲除定点整合

利用CRISPR/Cas9系统构建水通道蛋白9基因敲除小鼠

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解剖学报 2022年第1期53卷 126-131页

作者：程全成樊婧刘怀存丁慧如方璇王建伟陈春花张卫光北京大学基础医学院人体解剖学教研室北京100191

目的利用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠水通道蛋白9(AQP-9)基因,构建稳定敲除AQP-9基因的纯合子AQP-9^(-/-)小鼠。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,在Ensembl数据库上找到AQP-9基因序列的外显子区域,综合分析选定AQP-9-202的公共外显子2,前... 详细信息

目的利用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠水通道蛋白9(AQP-9)基因,构建稳定敲除AQP-9基因的纯合子AQP-9^(-/-)小鼠。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,在Ensembl数据库上找到AQP-9基因序列的外显子区域,综合分析选定AQP-9-202的公共外显子2,前期在其两边设计7个小向导RNA(sgRNA)靶点,选择合适靶点,将AQP-9敲除。用PCR以及基因测序手段检测基因敲除效果。获得F1代杂合子小鼠后,继而提供10只野生型小鼠(雌雄各5只)进行繁育,以期得到纯合子AQP-9^(-/-)小鼠。结果前期设计的7个sgRNA靶点基因活性均在95%以上,选择L2和R2作为最终的sgRNA靶点。注射受精卵74枚,移植60枚,得到6只F0代阳性鼠。经过繁育鉴定,最终得到稳定敲除AQP-9基因的纯合子AQP-9^(-/-)小鼠。结论利用CRISPR/Cas9系统获得全身敲除AQP-9基因且可稳定遗传的纯合子AQP-9^(-/-)小鼠。

关键词：水通道蛋白9 规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9 基因敲除基因型鉴定小鼠

Bcl3基因敲除对小鼠脾脏免疫细胞组成及抗肿瘤能力的影响

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中华微生物学和免疫学杂志 2022年第5期42卷 360-368页

作者：谢业成郭仪琳李雪露刘奂弟牛玉娜新乡医学院医学检验学院新乡453003 河南省免疫与靶向药物重点实验室新乡453003

目的观察Bcl3基因敲除对小鼠脾脏免疫细胞的组成及抗肿瘤能力的影响。方法使用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立Bcl3基因敲除小鼠(Bcl3^(-/-)),血常规检验和流式细胞术检测Bcl3^(-/-)小鼠的免疫细胞组成;建立B16F10黑色素瘤肺转移小鼠模型,... 详细信息

目的观察Bcl3基因敲除对小鼠脾脏免疫细胞的组成及抗肿瘤能力的影响。方法使用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立Bcl3基因敲除小鼠(Bcl3^(-/-)),血常规检验和流式细胞术检测Bcl3^(-/-)小鼠的免疫细胞组成;建立B16F10黑色素瘤肺转移小鼠模型,记录肺部肿瘤结节数和小鼠生存时间,对比野生型(wild type,WT)小鼠和Bcl3^(-/-)小鼠的抗肿瘤能力。结果Bcl3^(-/-)小鼠成功繁育成品系,子代基因敲除纯合小鼠无胚胎致死现象,且生长正常,与WT小鼠相比外观、生长发育、繁育性能未见明显差异;主要脏器无明显异常,但脾脏肿大且脾脏免疫细胞总数明显增加(P基因敲除影响免疫细胞的发育、分化和功能,继而影响机体的抗肿瘤能力。

关键词： Bcl3转录共激活因子基因敲除抗肿瘤免疫免疫细胞

枸杞多糖对髓样分化因子88基因敲除小鼠2型糖尿病模型炎症因子的影响

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上海交通大学学报（医学版） 2019年第2期39卷 136-141页

作者：王凌霄刘婷婷杨晓辉姚智卿蔡慧珍宁夏医科大学公共卫生与管理学院银川750004

目的·研究枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide,LBP)对髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88基因敲除(MyD88-/-)小鼠2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)模型炎症因子的影响。方法·采用不同浓度LBP(20、40、80 mg/kg)干预MyD88-/-T2DM小鼠,ELISA法检测小鼠血清中白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、转化生长因子β1(TGF-β1)及IL-10的水平。采用不同浓度(25、50、100μg/mL)LBP预处理小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞,然后用脂多糖诱导炎症状态,Western blotting检测各组细胞核因子κB(NF-κB)的核转位变化,以及NF-κB抑制蛋白(IκB)和磷酸化IκB的蛋白水平。结果·LBP能够降低MyD88-/-T2DM小鼠血清IL-1β和TGF-β1的水平(均P<0.05)。体外实验表明,LBP可以剂量依赖性地抑制巨噬细胞中由脂多糖诱发的NF-κB核转位,同时高剂量的LBP可以抑制IκB磷酸化。结论·LBP可以抑制MyD88-/-T2DM小鼠部分促炎症因子,这种调节作用可能与其弱化巨噬细胞IκB磷酸化,抑制NF-κB核转位有关。

关键词：枸杞多糖髓样分化因子88 基因敲除 2 型糖尿病巨噬细胞炎症因子核因子κ B

猪链球菌2型分选酶srtBCD基因敲除株的构建及其生物学特性分析

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微生物学报 2011年第3期51卷 386-392页

作者：陈红娜廖辉王长军潘秀珍唐家琪南京军区军事医学研究所南京210002 南京医科大学基础医学院南京210029

【目的】阐明分选酶srtBCD基因在猪链球菌2型致病过程中的作用。【方法】利用同源重组原理构建中间为壮观霉素、两侧为srtBCD基因上下游片段的重组质粒,将构建好的质粒电转化入猪链球菌感受态,筛选srtBCD缺失的突变株,并通过组合PCR和... 详细信息

【目的】阐明分选酶srtBCD基因在猪链球菌2型致病过程中的作用。【方法】利用同源重组原理构建中间为壮观霉素、两侧为srtBCD基因上下游片段的重组质粒,将构建好的质粒电转化入猪链球菌感受态,筛选srtBCD缺失的突变株,并通过组合PCR和逆转录PCR对其进行验证。生物学功能实验研究srtBCD突变株和野毒株05Z33在生长速率、粘附、毒力等方面的差异。【结果】组合PCR和逆转录PCR结果均证实srtBCD突变株构建成功,体外实验结果显示srtBCD缺失后细菌的生长速率减慢,与Hep-2上皮细胞的粘附率明显降低,小鼠毒力实验数据表明突变株毒力无明显变化。【结论】猪链球菌2型srtBCD基因与细菌的粘附能力有关,为进一步研究猪链球菌2型的致病机理奠定基础。

关键词：猪链球菌2型 sortase BCD 基因敲除粘附毒力

Red重组系统在痢疾杆菌基因敲除中的应用研究

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微生物学报 2003年第6期43卷 740-746页

作者：胡堃史兆兴王恒樑冯尔玲黄留玉军事医学科学院生物工程研究所

利用λ噬菌体的Red系统在细菌中进行基因敲除的技术 ,最近发展较快 ,但多在大肠杆菌中进行。以alkA、wcaJ、yphF和dam 4个基因为例 ,分别在大肠杆菌和痢疾杆菌中利用Red系统进行基因敲除。对于大肠杆菌 ,除dam基因外 ,其余 3个基因均能... 详细信息

利用λ噬菌体的Red系统在细菌中进行基因敲除的技术 ,最近发展较快 ,但多在大肠杆菌中进行。以alkA、wcaJ、yphF和dam 4个基因为例 ,分别在大肠杆菌和痢疾杆菌中利用Red系统进行基因敲除。对于大肠杆菌 ,除dam基因外 ,其余 3个基因均能被有效敲除 ,而在痢疾杆菌中只能敲除一个alkA基因。结果表明 ,为使该系统能有效地应用于痢疾杆菌和其它细菌 ,还需对该系统进行改进。

关键词： Red系统基因敲除突变体重组系统痢疾杆菌