POLQ基因敲除293T细胞系的构建及其在外源基因定点整合中的应用

作     者：王瑶 姜志洋 蔡军雨 樊榕榕 贾姗姗 冯健男 石艳春 王晶 郑源强 WANG Yao;JIANG Zhiyang;CAI Junyu;FAN Rongrong;JIA Shanshan;FENG Jiannan;SHI Yanchun;WANG Jing;ZHENG Yuanqiang

作者机构：内蒙古医科大学内蒙古自治区分子生物学重点实验室呼和浩特010058 军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所国家安全特需药品全国重点实验室北京100850 

出 版 物：《中国生物工程杂志》 (China Biotechnology)

年 卷 期：2024年第44卷第5期

页      面：40-55页

核心收录：

学科分类：08[工学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：科技部国家重点研发计划(2023YFC2605002) 北京市自然科学基金(7222262) 内蒙古自治区自然科学基金(2022MS08011)资助项目 

主　　题：CRISPR/Cas9 POLQ 293T细胞 基因敲除 定点整合 

摘      要：目的:利用CRISPR/Cas9技术构建POLQ基因敲除293T细胞系,并探讨该敲除细胞系在外源基因定点整合方面的应用。方法:构建靶向POLQ基因的pX330-sgRNA打靶载体,通过T7EI酶切验证,选取打靶效率最高的载体,转染293T细胞;利用流式细胞分选术、稳定单细胞克隆培养、TA克隆测序及蛋白质印迹等方法验证POLQ敲除情况;利用靶向AAVS1和FBL位点的含GFP/mCherry报告基因同源打靶载体,评估敲除的293T POLQ-/-细胞系在外源基因定点整合效率的变化,并通过测序方式验证供体报告载体是否定点整合到基因组中;最后分析POLQ敲除对293T细胞增殖和存活率的影响。结果:成功在293T细胞中稳定敲除POLQ基因;通过报告基因实验验证,敲除细胞系中外源基因定点整合效率平均提高2~7倍,且敲除POLQ基因对293T细胞系增殖和存活率没有明显影响。结论:成功利用CRISPR/Cas9技术构建具有高效定点整合能力的POLQ基因稳定敲除293T细胞系,为进一步利用该细胞系高效制备稳定整合外源基因(包括抗体基因)工程化细胞系奠定基础。