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坏死杆菌外膜囊泡诱导羊中性粒细胞自噬和NLRP3炎性小体的研究

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中国预防兽医学报 2023年第12期45卷 1272-1278页

作者：毕栏赵鹏宇王天硕于思雯肖佳薇郭东华黑龙江八一农垦大学动物科技学院/农业农村部东北寒区牛病防治重点实验室黑龙江大庆163319

为探究坏死杆菌(Fn)外膜囊泡(OMV)对羊中性粒细胞自噬及NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体激活的影响,本研究提取并纯化Fn OMV,经透射电子显微镜观察并测定纯度后,以5μg/mL的OMV刺激羊中性粒细胞1 h、2 h、4 h、6 h,以未刺激的细胞作为对... 详细信息

为探究坏死杆菌(Fn)外膜囊泡(OMV)对羊中性粒细胞自噬及NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体激活的影响,本研究提取并纯化Fn OMV,经透射电子显微镜观察并测定纯度后,以5μg/mL的OMV刺激羊中性粒细胞1 h、2 h、4 h、6 h,以未刺激的细胞作为对照组,经姬姆萨染色和倒置光学显微镜观察羊中性粒细胞形态。电镜观察可见OMV为球形囊泡状结构且纯度较高。姬姆萨染色结果显示,细胞为典型的杆状核和分叶核样中性粒细胞。光学显微镜观察结果显示,对照组羊中性粒细胞为圆形,而5μg/mL OMV刺激组细胞出现细胞肿胀、体积变大变形的现象,且刺激2 h~6 h上述细胞变化更明显。采用荧光定量RT-PCR检测OMV刺激后的羊中性粒细胞中炎性小体相关基因NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18,自噬相关基因mTOR、Beclin 1、MAP1LC3B、P62 mRNA的相对转录水平。结果显示,与对照组相比,OMV刺激1 h时GSDMD mRNA的相对转录水平极显著升高(P<0.0001),其他炎性小体相关基因mRNA的相对转录水平无显著变化;刺激2 h时GSDMD mRNA的相对转录水平显著下降(P<0.05),炎性小体相关基因NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA的相对转录水平均显著升高(P<0.05);刺激4 h和6 h时GSDMD mRNA的相对转录平极显著下降(P<0.0001),NLRP3、IL-1βmRNA的相对转录水平均显著升高(P<0.05),Caspase-1、IL-18 mRNA的相对转录水平均无显著变化。自噬相关基因mTOR、Beclin 1、MAP1LC3B、P62 mRNA的相对转录水平在不同刺激时间后均显著升高(P<0.05)。上述结果表明,5μg/mL的Fn OMV刺激羊中性粒细胞2 h可激活NLRP3炎性小体;5μg/mL的Fn OMV可在基因水平上启动羊中性粒细胞自噬并形成自噬小体。本研究为Fn的致病机制研究奠定了基础。

关键词：坏死杆菌外膜囊泡 NLRP3炎性小体自噬

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坏死杆菌白细胞毒素的研究进展

中国预防兽医学报 2020年第10期42卷 1079-1083页

作者：肖佳薇蒋剑成贺显晶汪锋锋王丽娜郭东华黑龙江八一农垦大学动物科技学院/黑龙江省牛病防制重点实验室黑龙江大庆163319

坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)是一种革兰氏阴性严格厌氧菌,是与坏死性感染有关的机会性病原体,可引起牛、羊和人等非常严重甚至致命的疾病。坏死杆菌能够独立引起感染,也能与其它病原体(尤其是化脓曲霉菌和利氏卟啉单胞菌)协同... 详细信息

坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)是一种革兰氏阴性严格厌氧菌,是与坏死性感染有关的机会性病原体,可引起牛、羊和人等非常严重甚至致命的疾病。坏死杆菌能够独立引起感染,也能与其它病原体(尤其是化脓曲霉菌和利氏卟啉单胞菌)协同感染[1-2]。坏死杆菌会直接或间接引起反刍动物的肝脓肿、腐蹄病、乳腺炎及子宫内膜炎,这些疾病在临床上极大增加了反刍动物的淘汰率,导致经济损失惨重。

关键词：坏死杆菌子宫内膜炎白细胞毒素腐蹄病反刍动物淘汰率乳腺炎厌氧菌

坏死杆菌白细胞毒素作为腐蹄病亚单位疫苗候选抗原的研究前景

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中国畜牧兽医 2009年第3期36卷 137-139页

作者：郭东华孙东波武瑞范春玲孙斌黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆163319

腐蹄病(foot rot)是侵害反刍动物趾间皮肤及深层软组织为主的,严重影响奶牛生产性能和产奶质量的一种常见疾病。由于传统的灭活菌苗具有免疫效果差、副反应严重及大量生产困难等缺点,使腐蹄病基因工程疫苗的研究成为热点。笔者对坏死杆... 详细信息

腐蹄病(foot rot)是侵害反刍动物趾间皮肤及深层软组织为主的,严重影响奶牛生产性能和产奶质量的一种常见疾病。由于传统的灭活菌苗具有免疫效果差、副反应严重及大量生产困难等缺点,使腐蹄病基因工程疫苗的研究成为热点。笔者对坏死杆菌白细胞毒素作为腐蹄病亚单位疫苗候选抗原研究的最新进展进行综述,希望为腐蹄病亚单位疫苗的研究提供参考。

关键词：腐蹄病坏死杆菌白细胞毒素亚单位疫苗

坏死杆菌43K OMP基因缺失株的生物学功能初步探究

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坏死杆菌43K OMP基因缺失株的生物学功能初步探究

作者：蒋凯黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum,***)是革兰阴性、严格厌氧的细菌,主要引起以组织坏死性、化脓性病变为主的反刍动物腐蹄病、肝脓肿和犊牛白喉,并参与奶牛乳房炎和子宫内膜炎的致病过程。43K OMP是坏死杆菌的一种重要外膜蛋白(Oute... 详细信息

坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum,***)是革兰阴性、严格厌氧的细菌,主要引起以组织坏死性、化脓性病变为主的反刍动物腐蹄病、肝脓肿和犊牛白喉,并参与奶牛乳房炎和子宫内膜炎的致病过程。43K OMP是坏死杆菌的一种重要外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMPs),可介导坏死杆菌黏附宿主细胞。43K OMP作为疫苗免疫小鼠对小鼠具有免疫保护作用。但43K OMP除黏附宿主细胞外的其他生物功能尚未完全揭示。为了研究43K OMP基因在坏死杆菌感染中的生物学功能,本文通过以下方法对43K OMP基因缺失株生物学特性进行研究。为明确缺陷43K OMP基因对坏死杆菌生物学特性的影响,本研究通过对坏死杆菌亲本株(A25)和缺失株(A25Δ43K OMP)的细菌形态、菌落形态、生长曲线、耐药性、生物被膜含量和形态、细胞黏附能力、抑制细胞增殖能力、诱导细胞凋亡能力和小鼠毒力进行对比。结果显示,亲本株A25与缺失株A25Δ43K OMP在细菌形态、菌落形态、生长曲线和抑制RAW264.7细胞增殖能力无显著差异;缺失株A25Δ43K OMP对克拉霉素、卡那霉素和多粘菌素B的药物敏感性增强,对氨苄西林、红霉素和磺胺甲噁唑的药物敏感性减弱,生物被膜含量显著增高(P坏死(6/10)。亲本株A25和缺失株A25Δ43K OMP的LD分别为3.66×10 CFU和9.44×10CFU,同亲本株相比,缺失株毒力下降约3倍。综上所述,坏死杆菌43K OMP基因能够参与坏死杆菌黏附宿主细胞过程,在坏死杆菌的耐药性和生物被膜形成中发挥重要作用,与坏死杆菌毒力相关。本研究为坏死杆菌43K OMP相关研究提供理论基础。

关键词：坏死杆菌外膜蛋白 43K OMP基因基因缺失生物被膜生物学特性 LD50

牛坏死杆菌43K OMP基因缺失株生物学特性分析

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畜牧兽医学报 2022年第11期53卷 4019-4026页

作者：蒋凯赵鹏宇王天硕于思雯毕栏肖佳薇贺显晶郭东华黑龙江八一农垦大学大庆163319

旨在研究牛坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)43K OMP基因的生物学功能。通过对比亲本株(A25株)和43K OMP基因缺失株(A25Δ43K OMP株)的体外生长速率、药物敏感性、生物被膜形成能力、对细胞的黏附能力、毒性以及对Balb/c雌性小鼠致... 详细信息

旨在研究牛坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)43K OMP基因的生物学功能。通过对比亲本株(A25株)和43K OMP基因缺失株(A25Δ43K OMP株)的体外生长速率、药物敏感性、生物被膜形成能力、对细胞的黏附能力、毒性以及对Balb/c雌性小鼠致病力,初步研究43K OMP基因在坏死杆菌致病中潜在的生物功能。结果显示,当43K OMP基因被缺陷后,牛坏死杆菌的体外生长速率和对细胞的毒性无显著差异(P>0.05);对克拉霉素、卡那霉素、新霉素、阿米卡星、奈替米星、呋喃妥因、多黏菌素B、利福平和环丙沙星耐药性减弱;培养72和96 h后,生物被膜形成能力显著增强(P坏死杆菌的黏附能力、生物被膜形成能力和耐药性有关。

关键词：坏死杆菌 43K OMP 细胞黏附生物被膜耐药性

牛坏死杆菌43K OMP单克隆抗体的制备及鉴定

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中国生物制品学杂志 2021年第1期34卷 89-92页

作者：贺显晶张思瑶蒋剑成王丽娜肖佳薇汪锋锋孙东波郭东华黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

目的制备牛坏死杆菌43K OMP单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法经IPTG诱导表达重组43K OMP,纯化后免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗43K OMP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗43K OMP单克隆抗体进行效价、... 详细信息

目的制备牛坏死杆菌43K OMP单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法经IPTG诱导表达重组43K OMP,纯化后免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗43K OMP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗43K OMP单克隆抗体进行效价、亚类、免疫原性及特异性鉴定。结果获得3株稳定表达抗43K OMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株,取其中效价最高的1株命名为O43,其重链为IgG1,轻链为κ链,上清和腹水效价分别为1∶25 600和1∶105;该单克隆抗体可与重组43K OMP发生特异性反应,且与转染后瞬时表达43K OMP的BHK-21细胞特异性结合,发生荧光反应。结论成功表达并纯化了43K OMP,制备了牛坏死杆菌43K OMP单克隆抗体,为研究坏死杆菌的感染机制及发病机理奠定了基础。

关键词：坏死杆菌牛 43K OMP 单克隆抗体

牛坏死杆菌白细胞毒素PL2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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中国生物制品学杂志 2022年第9期35卷 1118-1122,1127页

作者：郭东华肖佳薇王丽娜汪锋锋贺显晶蒋剑成孙东波黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江省牛病防制重点实验室黑龙江大庆163319

目的制备坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)白细胞毒素(leukotoxin)PL2蛋白单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法原核表达并纯化坏死杆菌白细胞毒素PL2蛋白,腹腔注射免疫BALB/c雌性小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,采用间接ELISA法筛... 详细信息

目的制备坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)白细胞毒素(leukotoxin)PL2蛋白单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法原核表达并纯化坏死杆菌白细胞毒素PL2蛋白,腹腔注射免疫BALB/c雌性小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,并用GST标签蛋白对阳性孔进行二次反向筛选,针对亚克隆后稳定分泌PL2蛋白单克隆抗体的细胞株制备腹水,对单克隆抗体进行抗体效价检测、抗体亚类和Western blot鉴定及杂交瘤染色体分析。结果成功筛选出1株稳定分泌坏死杆菌白细胞毒素PL2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2D5;杂交瘤细胞培养上清和腹水效价分别为1∶6400和1∶105;单克隆抗体重链为IgG3,轻链为κ链;杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体分别可与坏死杆菌培养液浓缩上清和重组PL2蛋白发生特异性反应,且与GST标签蛋白无反应;杂交瘤细胞染色体数目为102条,与预期一致。结论成功制备了牛坏死杆菌白细胞毒素PL2蛋白单克隆抗体,为坏死杆菌白细胞毒素致病机制的研究提供了工具。

关键词：坏死杆菌白细胞毒素 PL2蛋白单克隆抗体

牛坏死杆菌溶血素基因克隆、表达和抗原性分析

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黑龙江畜牧兽医 2015年第1期 140-142页

作者：孙东波吕思文高晶郭东华王建发武瑞王洪斌东北农业大学动物医学院哈尔滨150030 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

为了研制新型有效安全的牛坏死杆菌病亚单位疫苗和诊断试剂，试验利用PCR扩增技术获得了牛坏死杆菌H05菌株hly基因的全长及5个相互重叠的截短片段的核苷酸序列，并利用原核表达载体pET-32a对hly基因的5个截短片段进行了表达和抗原性分... 详细信息

为了研制新型有效安全的牛坏死杆菌病亚单位疫苗和诊断试剂，试验利用PCR扩增技术获得了牛坏死杆菌H05菌株hly基因的全长及5个相互重叠的截短片段的核苷酸序列，并利用原核表达载体pET-32a对hly基因的5个截短片段进行了表达和抗原性分析。结果表明：hly-2、hly-3和hly-4片段获得了成功表达，且hly-2（aa278～567）、hly-3（aa566～888）和hly-4（aa887～1163）重组蛋白能够与牛坏死杆菌多克隆抗体反应。说明hly-2、hly-3和hly-4可以用于研制新型牛坏死杆菌病亚单位疫苗和诊断试剂。

关键词：牛腐蹄病坏死杆菌溶血素截短片段原核表达抗原性

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河北省某牛场坏死杆菌的分离及鉴定

中国生物制品学杂志 2019年第7期32卷 770-773页

作者：蒋剑成张思瑶贺显晶肖佳薇王丽娜汪锋锋郭东华黑龙江八一农垦大学动物科技学院

目的对河北省张家口市某牛场奶牛腐烂蹄肢部组织坏死杆菌进行分离及鉴定。方法采集17份奶牛腐烂蹄肢部组织,在苛养厌氧培养基中进行培养,培养液涂片进行革兰染色,提取细菌基因组DNA,PCR法鉴定病料组织培养物基因组DNA,并进行测序。纯化... 详细信息

目的对河北省张家口市某牛场奶牛腐烂蹄肢部组织坏死杆菌进行分离及鉴定。方法采集17份奶牛腐烂蹄肢部组织,在苛养厌氧培养基中进行培养,培养液涂片进行革兰染色,提取细菌基因组DNA,PCR法鉴定病料组织培养物基因组DNA,并进行测序。纯化后细菌进行生化鉴定及药敏试验。结果病牛蹄组织革兰染色阴性,部分菌体呈杆状或长丝状;17份病牛蹄组织中共检测出7份坏死杆菌阳性样品;纯化后阳性菌液的生理生化特性与坏死梭杆菌基本一致;对亚胺培南(泰能)高度敏感,对氨苄西林/舒巴坦、红霉素、妥布霉素中度敏感,对克林霉素、青霉素G、氨苄西林、头孢唑啉、哌拉西啉耐药。结论该牛场确认发生腐蹄病疫情,且主要由坏死杆菌引起。

关键词：奶牛腐蹄病坏死杆菌分离鉴定