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中国免疫学杂志 2024年第10期40卷 2017-2030页

作者：王陈昆刘浩飞中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所纳米生物医学部纳米-生物界面重点实验室类器官创新中心苏州215123 中国科学技术大学纳米技术与纳米仿生学院合肥230026

肿瘤免疫治疗的有效性多借助于小鼠模型进行评价。但由于物种差异,传统小鼠模型不能完全模拟人体免疫应答的真实情况,导致大部分基于小鼠的研究成果不适用于人体。近年随着免疫缺陷小鼠的出现和品系改良,基于免疫缺陷小鼠构建的免疫系... 详细信息

肿瘤免疫治疗的有效性多借助于小鼠模型进行评价。但由于物种差异,传统小鼠模型不能完全模拟人体免疫应答的真实情况,导致大部分基于小鼠的研究成果不适用于人体。近年随着免疫缺陷小鼠的出现和品系改良,基于免疫缺陷小鼠构建的免疫系统人源化小鼠有望帮助研究者克服这一难题。本文就免疫缺陷小鼠模型和免疫系统人源化小鼠模型的最新研究进展和存在的问题以及免疫系统人源化小鼠在肿瘤免疫研究中的应用进行总结,为后续人源化小鼠模型的完善及其在肿瘤免疫治疗中的应用提供参考。

关键词：免疫缺陷小鼠免疫系统人源化小鼠肿瘤免疫治疗

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免疫系统人源化小鼠模型的现状及应用

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实验动物科学 2012年第6期29卷 52-55页

作者：孙丽娜孙晨鸣赵勇中国科学院动物研究所生物膜与膜生物工程国家重点实验室北京100101

实验动物模型在医学生命科学发展中发挥着重要作用。某些病原微生物仅仅特异对人类具有易感性及致病性。由于缺乏理想的实验动物模型限制了人们对疾病发病机理的理解及预防治疗。因动物种属差异,许多对小鼠有效的药物及疫苗不能有效地... 详细信息

实验动物模型在医学生命科学发展中发挥着重要作用。某些病原微生物仅仅特异对人类具有易感性及致病性。由于缺乏理想的实验动物模型限制了人们对疾病发病机理的理解及预防治疗。因动物种属差异,许多对小鼠有效的药物及疫苗不能有效地用于人类疾病的治疗或预防。通过将人的胚胎胸腺、造血干细胞等移植到免疫缺陷小鼠可有效地建立人类天然与适应性免疫系统,即免疫系统人源化小鼠。该小鼠的成功建立为免疫系统相关疾病研究及免疫药物研发提供了良好实验模型。本文主要对免疫系统人源化小鼠模型的建立、发展及其在感染等研究中的应用进行简要综述。

关键词：免疫系统人源化小鼠 HIV感染疟疾免疫缺陷小鼠胸腺

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基于piggyBac转座子系统构建长期表达人细胞因子的免疫缺陷小鼠模型

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吉林大学学报（医学版） 2020年第1期46卷 176-181页

作者：吕亚楠范伟胡正吉林大学第一医院转化医学院/免疫学研究所

目的:探讨表达人白细胞介素6 (IL-6)、白细胞介素3 (IL-3)、白细胞介素15 (IL-15)、干细胞生长因子(SCF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的piggyBac (PB)转座子系统在免疫缺陷小鼠体内的长效表达情况,为改善人源化小鼠模型... 详细信息

目的:探讨表达人白细胞介素6 (IL-6)、白细胞介素3 (IL-3)、白细胞介素15 (IL-15)、干细胞生长因子(SCF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的piggyBac (PB)转座子系统在免疫缺陷小鼠体内的长效表达情况,为改善人源化小鼠模型中人免疫细胞的重建提供简单长效的新方法。方法:构建含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的PB转座子质粒(PB-GFP),构建含有人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF基因的PB转座子质粒(PB-5F)。293T细胞分为阴性对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pLVTHM质粒)、瞬时转染组(转染PB-GFP质粒)和稳定转染组[共同转染PB-GFP和转座酶质粒(super-PB)]。转染后每3d,采用流式细胞术检测各组细胞中GFP阳性(GFP+)细胞百分率。将***-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NCG)小鼠分为瞬时转染组和稳定转染组,瞬时转染组小鼠尾静脉高压注射PB-5F质粒,稳定转染组小鼠尾静脉高压注射PB-5F质粒和super-PB质粒。小鼠尾静脉高压注射后1、3、5和9d及随后每周1次采血分离血清,ELISA法检测各组NCG小鼠血清中IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF水平。结果:PB-GFP转染293T细胞30d后,稳定转染组GFP+细胞百分率(4.61%±0.42%)明显高于阳性对照组(0.58%±0.05%)和瞬时转染组(0.86%±0.10%)(P小鼠尾静脉高压注射PB-5F质粒,注射后第30天,稳定转染组小鼠血清中IL-6、IL-15和GM-CSF水平均高于瞬时转染组(P=0.048,P=0.051,P=0.045);注射后第60天,稳定转染组小鼠血清中仍能检测到IL-6、IL-15和GM-CSF。结论:体外验证了PB转座子系统的长效表达,成功构建了具有人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF基因的PB转座子载体的质粒,建立了长效稳定表达人IL-6、IL-15和GM-CSF的免疫缺陷小鼠模型。

关键词：免疫系统人源化小鼠白细胞介素6 白细胞介素3 白细胞介素15 干细胞生长因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子转座子

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基于CRISPR/Cas9技术构建LDLR基因敲除的免疫缺陷小鼠模型及其表型分析

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吉林大学学报（医学版） 2022年第2期48卷 271-276页

作者：王兆卫吕亚楠胡正杨永广吉林大学第一医院器官再造与移植教育部重点实验室吉林长春130061

目的:基于CRISPR/Cas9技术构建低密度脂蛋白受体(LDLR)基因敲除的免疫缺陷小鼠模型,并对血液胆固醇水平进行分析评价,为构建具有高脂血症的免疫系统人源化小鼠模型提供新方法。方法:基于CRISPR/Cas9技术,将有效识别LDLR基因外显子2和18... 详细信息

目的:基于CRISPR/Cas9技术构建低密度脂蛋白受体(LDLR)基因敲除的免疫缺陷小鼠模型,并对血液胆固醇水平进行分析评价,为构建具有高脂血症的免疫系统人源化小鼠模型提供新方法。方法:基于CRISPR/Cas9技术,将有效识别LDLR基因外显子2和18的sgRNA/Cas9 mRNA注射到NOD SCID小鼠的受精卵中,通过对新生小鼠基因型鉴定筛选得到基因敲除的F0代阳性(LDLR^(+/-),Aa)小鼠,再将此小鼠与NOD SCID(LDLR^(+/+),AA)小鼠繁育,鉴定得到能稳定遗传基因型的F1代(Aa)小鼠。将F1代阳性杂合小鼠与NOD SCID小鼠繁育,获得大量基因序列完全相同的F2代(Aa)小鼠,在F2代间进行大规模繁育,获得的F3代小鼠依据基因型和性别进行分组,分别为雄性AA、雄性Aa、雌性AA和雌性Aa,对体质量进行监测,同时采集外周血进行血液胆固醇水平检测。结果:通过上述构建方法获得了NOD SCID LDLR^(+/-)(Aa)小鼠,经过8周的体质量检测,Aa杂合子基因型在生长发育过程中并不影响小鼠体质量,雌性Aa的胆固醇水平为(100.80±4.42)mg·dL^(-1),雄性Aa的胆固醇水平为(120.56±11.16)mg·dL^(-1),与阴性对照(基因型为AA的小鼠)比较,胆固醇水平明显升高(P小鼠体质量的前提下,通过CRISPR/Cas9技术在NOD SCID背景下成功构建出了胆固醇水平自发升高的小鼠模型。

关键词：高脂血症免疫系统人源化小鼠低密度脂蛋白受体胆固醇 CRISPR/Cas9技术

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高脂血症的免疫缺陷小鼠模型的构建

高脂血症的免疫缺陷小鼠模型的构建

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作者：王兆卫吉林大学

学位级别：硕士

背景及目的:高脂血症又称血脂谱异常症,是指血浆中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白中其中一种或多种水平升高。临床上,又可以根据发病原因可以分为先天发病和后天发病两类。先天高血脂症大多数是由于家族性遗传低密度脂蛋白受体基因... 详细信息

背景及目的:高脂血症又称血脂谱异常症,是指血浆中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白中其中一种或多种水平升高。临床上,又可以根据发病原因可以分为先天发病和后天发病两类。先天高血脂症大多数是由于家族性遗传低密度脂蛋白受体基因缺陷导致的,分为单基因高脂血症和散发性或多基因高脂血症,后天高脂血症的主要致病因素是高脂高热量饮食的不良生活习惯和一些疾病等。高脂血症的病理生理过程复杂,高脂血症的最主要后果是导致脂质在血管内皮沉积,引起动脉粥样硬化和心脑血管方面的疾病。高脂血症对我国国民健康已造成重大影响,据统计,我国约有9000万人患有高脂血症。因此,开展高脂血症的病理机制研究对于有效治疗、预防高脂血症及相关疾病十分重要。高脂血症患者体内免疫系统会出现慢性炎症和异常活化状态,这与糖尿病、动脉粥样硬化等伴发疾病的发生和发展密切相关。早期报道发现肥胖小鼠的内脏脂肪组织中大量表达TNF-α,揭示了肥胖所引发高血脂、糖尿病与慢性炎症之间的联系。早期的研究主要集中在天然免疫细胞的异常活化在脂代谢异常相关疾病进程中的作用。在分子水平上,高脂血症会使巨噬细胞以及其他免疫细胞蓄积胆固醇,导致Toll样受体(TLR)和炎症小体活化;在细胞水平上,TLR信号的激活会引起胆固醇外排减少,会使胆固醇更加积聚,增强机体炎症反应。这些天然免疫系统慢性活化已被证明与动脉粥样硬化和胰岛素抵抗的病理机理密切相关。近期的研究显示适应性免疫系统慢性活化也在高脂血症及相关伴发疾病的病理过程中起着重要作用。例如,在动脉粥样硬化斑块中积聚的T细胞多表现为Th1亚型,可产生IFN-γ和TNF-α等炎性因子,而活化的T和B淋巴细胞存在于坏死性脂肪细胞周围,可诱发胰岛素抵抗。动物模型是研究高脂血症免疫病理机制并研发相关新药的重要工具。近年出现了具有人免疫系统的人源化小鼠模型,因此可在该模型的基础上直接研究部分人免疫系统相关疾病的病理过程,该模型广泛应用于感染、肿瘤、移植、自身免疫病、再生医学等领域,成为沟通基础研究和临床应用的桥梁。研究人员采用近交系LDLR-KO C57BL/6J小鼠作为金标准,然而这种小鼠有很强的T细胞亚群偏向,不能完全适用更为复杂的人的免疫系统的研究。并且小鼠和人类免疫系统具有很大的差异,这导致从普通小鼠模型中获得的研究成果常无法解释人类的生理或病理问题。免疫系统人源化小鼠模型为研究高胆固醇对人体免疫细胞功能的作用提供了一条新的途径。经过约30年的发展,主要有两类免疫系统人源化小鼠模型应用最为广泛。一种是给免疫缺陷小鼠幼崽注射人源脐带血CD34细胞建立的免疫系统人源化小鼠模型;另一种免疫系统人源化小鼠模型是在人胚胎胸腺移植给免疫缺陷小鼠的同时,尾静脉注射CD34人胚胎肝细胞移植,这种免疫系统人源化小鼠模型也称为BLT小鼠。第二种免疫系统人源化小鼠被认为是研究人免疫相关疾病的最佳体内模型之一。近期研究表明:通过对NSG小鼠进行高脂喂养和前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型-腺相关病毒8(adeno-associated virus 8–proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,AAV8-PCSK9)的感染,可以用于模拟高血脂条件下的人免疫功能异常。但该方法较为复杂,不易于推广应用。因此,本研究选择对NOD/SCID小鼠进行LDLR基因敲除,使其LDLR表达量减少,使小鼠体内LDL-C含量升高,以此作为后期免疫系统人源化的基础。该方法与目前已报道的策略相比,简单且长效。研究方法:1.选择了NOD SCID小鼠作为基因编辑的基础,通过使用显微注射和Crispr/Cas9技术,将小鼠低密度脂蛋白受体基因的外显子2-18敲除。用PCR技术鉴定得到了LDLR基因缺陷的杂合子后代小鼠。2.检测后代野生型和杂合子小鼠的血脂及体重。3.使用病理HE染色,检测并确定了杂合子小鼠的后代胚胎吸收情况。研究结果:1.得到了后代LDLR基因缺陷的杂合子小鼠。2.检测得到的杂合子小鼠血脂相对于野生型小鼠有升高。3.发现了后代胚胎吸收的情况。研究结论:运用Crispr/Cas9技术,敲除NOD SCID小鼠的LDLR基因,得到的杂合子后代相对于野生型血脂升高。

关键词：高脂血症免疫系统人源化小鼠 LDLR 胆固醇水平 Crispr/Cas9

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基于转座子载体高压注射的免疫缺陷小鼠体内多种人淋巴因子长期表达策略的研究

基于转座子载体高压注射的免疫缺陷小鼠体内多种人淋巴因子长期表...

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作者：范伟吉林大学

学位级别：硕士

研究目的:免疫系统人源化小鼠是研究最多应用最广的人源化小鼠之一,其特点是具有人的免疫系统,被认为是生物医药领域研究的理想小动物模型。经过几十年的研究和发展,该模型日趋成熟。但因缺乏某些人类细胞发育存活所必需的细胞因子,导... 详细信息

研究目的:免疫系统人源化小鼠是研究最多应用最广的人源化小鼠之一,其特点是具有人的免疫系统,被认为是生物医药领域研究的理想小动物模型。经过几十年的研究和发展,该模型日趋成熟。但因缺乏某些人类细胞发育存活所必需的细胞因子,导致某些血系细胞重建效果不佳。有报道显示小鼠IL 4、GM-CSF、CSF、IL 3等细胞因子有种属特异性,与人类细胞无交叉反应。外源补充人IL15、EPO及IL 3给免疫系统人源化小鼠可增加人NK和红细胞的重建比例。因此,补充合适的细胞因子可弥补当前人源化小鼠模型髓系和红系细胞重建不佳的缺陷,使该模型得到更广泛的应用。因此本课题通过构建含有人IL 6、IL 3、IL 15、SCF、GM-CSF五种细胞因子的表达质粒,利用PiggyBac(PB)转座子体系将目的基因整合到宿主小鼠细胞基因组中实现长期表达,以此优化免疫系统人源化小鼠模型。研究方法:利用分子生物学手段构建含有人IL 6、IL 3、IL 15、SCF、GM-CSF五种细胞因子的表达质粒(PB-5F);经氨苄青霉素培养基筛选,挑取单克隆进行NheI和BamHI双酶切以及琼脂糖电泳筛选出含有目的基因大小的阳性克隆;阳性克隆送库美生物科技有限公司测序;采用细胞转染技术将含有绿色荧光蛋白基因的转座子质粒(PB-GFP)和PB转座酶质粒(Super PB)按2.5:1的比例共转染进入293T细胞系,利用倒置荧光显微镜和流式细胞术检测绿色荧光蛋白的表达;将目的质粒(PB-5F)(50μg/只)和Super PB(20μg/只)混合后高压注射入NCG免疫缺陷小鼠体内,在确定的时间点取小鼠血清,应用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分别检测5种细胞因子的表达、含量及持续时间。研究结果:PB-5F质粒经过双酶切和琼脂糖凝胶电泳证明,插入片段与目的基因5F片段大小相符,测序结果证明插入序列与5F基因序列一致。体外细胞转染实验显示,在细胞转染7天内瞬时转染组GFP阳性率与稳定转染组没有明显差异;随后瞬时转染组几乎检测不到GFP的表达,而稳定转染组可以维持30天以上的表达。小鼠血清中人的细胞因子在注射后第5天瞬时转染组和稳定转染组各细胞因子之间无统计学差异,与体外转染实验结果一致;2个月后稳定转染组依然能检测到人细胞因子的表达。研究结论:(1)成功构建了含有人IL 6、IL 3、IL 15、SCF、GM-CSF基因的PB转座子质粒PB-5F;(2)PB转座子体系可维持人类细胞因子在小鼠体内的长期表达。

关键词：免疫系统人源化小鼠 IL6 IL3 IL15 SCF GM-CSF 转座子

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