基于转座子载体高压注射的免疫缺陷小鼠体内多种人淋巴因子长期表达策略的研究

作     者：范伟 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨永广

授予年度：2018年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：免疫系统人源化小鼠 IL6 IL3 IL15 SCF GM-CSF 转座子 

摘      要：研究目的:免疫系统人源化小鼠是研究最多应用最广的人源化小鼠之一,其特点是具有人的免疫系统,被认为是生物医药领域研究的理想小动物模型。经过几十年的研究和发展,该模型日趋成熟。但因缺乏某些人类细胞发育存活所必需的细胞因子,导致某些血系细胞重建效果不佳。有报道显示小鼠IL 4、GM-CSF、CSF、IL 3等细胞因子有种属特异性,与人类细胞无交叉反应。外源补充人IL15、EPO及IL 3给免疫系统人源化小鼠可增加人NK和红细胞的重建比例。因此,补充合适的细胞因子可弥补当前人源化小鼠模型髓系和红系细胞重建不佳的缺陷,使该模型得到更广泛的应用。因此本课题通过构建含有人IL 6、IL 3、IL 15、SCF、GM-CSF五种细胞因子的表达质粒,利用PiggyBac(PB)转座子体系将目的基因整合到宿主小鼠细胞基因组中实现长期表达,以此优化免疫系统人源化小鼠模型。研究方法:利用分子生物学手段构建含有人IL 6、IL 3、IL 15、SCF、GM-CSF五种细胞因子的表达质粒(PB-5F);经氨苄青霉素培养基筛选,挑取单克隆进行NheI和BamHI双酶切以及琼脂糖电泳筛选出含有目的基因大小的阳性克隆;阳性克隆送库美生物科技有限公司测序;采用细胞转染技术将含有绿色荧光蛋白基因的转座子质粒(PB-GFP)和PB转座酶质粒(Super PB)按2.5:1的比例共转染进入293T细胞系,利用倒置荧光显微镜和流式细胞术检测绿色荧光蛋白的表达;将目的质粒(PB-5F)(50μg/只)和Super PB(20μg/只)混合后高压注射入NCG免疫缺陷小鼠体内,在确定的时间点取小鼠血清,应用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分别检测5种细胞因子的表达、含量及持续时间。研究结果:PB-5F质粒经过双酶切和琼脂糖凝胶电泳证明,插入片段与目的基因5F片段大小相符,测序结果证明插入序列与5F基因序列一致。体外细胞转染实验显示,在细胞转染7天内瞬时转染组GFP阳性率与稳定转染组没有明显差异;随后瞬时转染组几乎检测不到GFP的表达,而稳定转染组可以维持30天以上的表达。小鼠血清中人的细胞因子在注射后第5天瞬时转染组和稳定转染组各细胞因子之间无统计学差异,与体外转染实验结果一致;2个月后稳定转染组依然能检测到人细胞因子的表达。研究结论:(1)成功构建了含有人IL 6、IL 3、IL 15、SCF、GM-CSF基因的PB转座子质粒PB-5F;(2)PB转座子体系可维持人类细胞因子在小鼠体内的长期表达。