高脂血症的免疫缺陷小鼠模型的构建

作     者：王兆卫 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨永广

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：高脂血症 免疫系统人源化小鼠 LDLR 胆固醇水平 Crispr/Cas9 

摘      要：背景及目的:高脂血症又称血脂谱异常症,是指血浆中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白中其中一种或多种水平升高。临床上,又可以根据发病原因可以分为先天发病和后天发病两类。先天高血脂症大多数是由于家族性遗传低密度脂蛋白受体基因缺陷导致的,分为单基因高脂血症和散发性或多基因高脂血症,后天高脂血症的主要致病因素是高脂高热量饮食的不良生活习惯和一些疾病等。高脂血症的病理生理过程复杂,高脂血症的最主要后果是导致脂质在血管内皮沉积,引起动脉粥样硬化和心脑血管方面的疾病。高脂血症对我国国民健康已造成重大影响,据统计,我国约有9000万人患有高脂血症。因此,开展高脂血症的病理机制研究对于有效治疗、预防高脂血症及相关疾病十分重要。高脂血症患者体内免疫系统会出现慢性炎症和异常活化状态,这与糖尿病、动脉粥样硬化等伴发疾病的发生和发展密切相关。早期报道发现肥胖小鼠的内脏脂肪组织中大量表达TNF-α,揭示了肥胖所引发高血脂、糖尿病与慢性炎症之间的联系。早期的研究主要集中在天然免疫细胞的异常活化在脂代谢异常相关疾病进程中的作用。在分子水平上,高脂血症会使巨噬细胞以及其他免疫细胞蓄积胆固醇,导致Toll样受体(TLR)和炎症小体活化;在细胞水平上,TLR信号的激活会引起胆固醇外排减少,会使胆固醇更加积聚,增强机体炎症反应。这些天然免疫系统慢性活化已被证明与动脉粥样硬化和胰岛素抵抗的病理机理密切相关。近期的研究显示适应性免疫系统慢性活化也在高脂血症及相关伴发疾病的病理过程中起着重要作用。例如,在动脉粥样硬化斑块中积聚的T细胞多表现为Th1亚型,可产生IFN-γ和TNF-α等炎性因子,而活化的T和B淋巴细胞存在于坏死性脂肪细胞周围,可诱发胰岛素抵抗。动物模型是研究高脂血症免疫病理机制并研发相关新药的重要工具。近年出现了具有人免疫系统的人源化小鼠模型,因此可在该模型的基础上直接研究部分人免疫系统相关疾病的病理过程,该模型广泛应用于感染、肿瘤、移植、自身免疫病、再生医学等领域,成为沟通基础研究和临床应用的桥梁。研究人员采用近交系LDLR-KO C57BL/6J小鼠作为金标准,然而这种小鼠有很强的T细胞亚群偏向,不能完全适用更为复杂的人的免疫系统的研究。并且小鼠和人类免疫系统具有很大的差异,这导致从普通小鼠模型中获得的研究成果常无法解释人类的生理或病理问题。免疫系统人源化小鼠模型为研究高胆固醇对人体免疫细胞功能的作用提供了一条新的途径。经过约30年的发展,主要有两类免疫系统人源化小鼠模型应用最为广泛。一种是给免疫缺陷小鼠幼崽注射人源脐带血CD34细胞建立的免疫系统人源化小鼠模型;另一种免疫系统人源化小鼠模型是在人胚胎胸腺移植给免疫缺陷小鼠的同时,尾静脉注射CD34人胚胎肝细胞移植,这种免疫系统人源化小鼠模型也称为BLT小鼠。第二种免疫系统人源化小鼠被认为是研究人免疫相关疾病的最佳体内模型之一。近期研究表明:通过对NSG小鼠进行高脂喂养和前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型-腺相关病毒8(adeno-associated virus 8–proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,AAV8-PCSK9)的感染,可以用于模拟高血脂条件下的人免疫功能异常。但该方法较为复杂,不易于推广应用。因此,本研究选择对NOD/SCID小鼠进行LDLR基因敲除,使其LDLR表达量减少,使小鼠体内LDL-C含量升高,以此作为后期免疫系统人源化的基础。该方法与目前已报道的策略相比,简单且长效。研究方法:1.选择了NOD SCID小鼠作为基因编辑的基础,通过使用显微注射和Crispr/Cas9技术,将小鼠低密度脂蛋白受体基因的外显子2-18敲除。用PCR技术鉴定得到了LDLR基因缺陷的杂合子后代小鼠。2.检测后代野生型和杂合子小鼠的血脂及体重。3.使用病理HE染色,检测并确定了杂合子小鼠的后代胚胎吸收情况。研究结果:1.得到了后代LDLR基因缺陷的杂合子小鼠。2.检测得到的杂合子小鼠血脂相对于野生型小鼠有升高。3.发现了后代胚胎吸收的情况。研究结论:运用Crispr/Cas9技术,敲除NOD SCID小鼠的LDLR基因,得到的杂合子后代相对于野生型血脂升高。