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作者：纪亚楠内蒙古农业大学

学位级别：硕士

乳酸菌有很多益生功能,但乳酸菌的生长容易受到环境胁迫而发生变化,若以生物膜的形式存在,能有效抵抗不良环境,进而正常生长,并持续发挥益生作用。信号分子ai-2作为群体感应重要的信号物质,参与调节细菌生物膜形成在内的多种生理功能。... 详细信息

乳酸菌有很多益生功能,但乳酸菌的生长容易受到环境胁迫而发生变化,若以生物膜的形式存在,能有效抵抗不良环境,进而正常生长,并持续发挥益生作用。信号分子ai-2作为群体感应重要的信号物质,参与调节细菌生物膜形成在内的多种生理功能。本试验以前期分离自发酵乳制品中的植物乳杆菌5-4-1和乳酸片球菌TG1-1-10为研究对象,探究不同环境因素胁迫下菌株生物膜形成、胞外多糖产量及信号分子ai-2活性的影响,同时,以生物膜最大形成量为指标,建立四因素三水平的正交试验,获得两株乳酸菌形成生物膜的最佳环境条件。主要结果如下:不同pH值和培养温度胁迫下,两株试验菌株生物膜的形成基本不受影响;在pH 4.5、5.5和温度胁迫时,两株试验菌株的菌体密度、胞外多糖和信号分子ai-2分泌量会相应减少。NaCl质量分数为3.0%和4.5%时有利于植物乳杆菌5-4-1和乳酸片球菌TG1-1-10生物膜形成;随NaCl质量分数增加,试验菌株菌体密度降低;在一定NaCl质量分数胁迫时,两株试验菌株信号分子ai-2和胞外多糖的分泌速度提高,胁迫增加时,二者均受到影响。营养胁迫对生物膜基本无显著影响;试验菌株菌体密度与浮游态胞外多糖均随营养物质浓度的降低受到抑制;被膜态胞外多糖在营养物质浓度为80%时有所提高,胁迫增加时受抑制;试验菌株在营养物质浓度为20%和40%时,会分泌更多的信号分子ai-2。通过正交优化试验,得出植物乳杆菌5-4-1生物膜形成的最佳环境条件为:培养基pH值为7.5,培养温度为44℃,NaCl质量分数为1.5%,营养物质浓度为100%。乳酸片球菌TG1-1-10生物膜形成的最佳环境条件为:培养基pH值为7.5,培养温度为30℃,NaCl质量分数为4.5%,营养物质浓度为80%。

关键词：乳酸菌环境胁迫生物膜信号分子ai-2 胞外多糖

群体感应抑制剂对发酵乳杆菌生物膜生成的影响

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中国食品学报 2022年第11期22卷 37-46页

作者：郑砚学张悦王艳聂丽丽乔瑞芳贺银凤内蒙古农业大学食品科学与工程学院呼和浩特010018

以课题组前期筛选出的2株高产信号分子ai-2的发酵乳杆菌2-1和211为研究对象,选择D-半乳糖、D-核糖和呋喃酮作为群体感应抑制剂,采用化学发光法和结晶紫染色法测定2株发酵乳杆菌的ai-2活性以及生物膜形成量。结果表明:一定浓度的3种抑制... 详细信息

以课题组前期筛选出的2株高产信号分子ai-2的发酵乳杆菌2-1和211为研究对象,选择D-半乳糖、D-核糖和呋喃酮作为群体感应抑制剂,采用化学发光法和结晶紫染色法测定2株发酵乳杆菌的ai-2活性以及生物膜形成量。结果表明:一定浓度的3种抑制剂都可以抑制2株发酵乳杆菌信号分子ai-2的活性,其中200μmol/L D-核糖对菌株2-1 ai-2活性抑制效果最好,抑制率为19.65%,50μmol/L D-核糖对菌株211 ai-2的活性抑制效果最好,抑制率为28.57%;同时不同浓度的抑制剂对2株发酵乳杆菌的生物膜形成量都有一定的抑制作用,对其生长量的影响并不显著。扫描电镜结果显示添加D-核糖对2株发酵乳杆菌生物膜状态下的菌体形态虽无明显影响,但会降低细菌的黏附性。

关键词：群体感应抑制剂发酵乳杆菌生物膜信号分子ai-2

类植物乳杆菌L-ZS9生物被膜态的黏附能力及形成影响因素

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食品科学 2016年第15期37卷 136-143页

作者：刘蕾武瑞赟李军李平兰中国农业大学食品科学与营养工程学院北京食品营养与人类健康高精尖创新中心北京100083 内蒙古大学生命科学学院内蒙古呼和浩特010021

旨在探究生物被膜态类植物乳杆菌L-ZS9的黏附能力,并确定影响其形成的主要因素。通过体外黏附实验,比较L-ZS9浮游与生物被膜两种状态下的黏附能力。结果表明,被膜态L-ZS9黏附率为浮游态的1.5倍,且黏附相关基因fbb、rop N和rrf2均上调表... 详细信息

旨在探究生物被膜态类植物乳杆菌L-ZS9的黏附能力,并确定影响其形成的主要因素。通过体外黏附实验,比较L-ZS9浮游与生物被膜两种状态下的黏附能力。结果表明,被膜态L-ZS9黏附率为浮游态的1.5倍,且黏附相关基因fbb、rop N和rrf2均上调表达,显示了被膜态的黏附优势。采用结晶紫染色法考察了培养时间、温度、营养物质、蛋白酶、群体感应自诱导信号分子(autoinducer-2,ai-2)对L-ZS9被膜形成的影响。结果显示,L-ZS9于37℃培养36 h被膜形成量最多,维持营养物质充足有利于被膜的形成,各营养物质在不同阶段发挥不同作用;低p H值和胆盐会破坏已经形成的生物被膜;胃蛋白酶和胰蛋白酶不仅抑制初始被膜的形成,且可以破坏成熟的被膜;体积分数0.5%的信号分子ai-2对被膜形成的促进作用最强,并可缓解胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用。

关键词：类植物乳杆菌L-ZS9 黏附生物被膜影响因素信号分子ai-2

禽致病性大肠杆菌安徽分离株luxS和pfs基因的克隆、表达与细胞外合成ai-2活性检测

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微生物学报 2012年第9期52卷 1167-1172页

作者：韩先干白灏刘蕾陈文静丁铲胡青海祁克宗于圣青中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 安徽农业大学动物科技学院合肥230036

【目的】LuxS/ai-2型密度感应系统存在于革兰氏阴性和阳性菌中,可产生用于细菌种间交流的通用自诱导信号分子ai-2(Autoinducer-2,ai-2),细菌许多生理功能都受此系统的调节。本研究开展对禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia ... 详细信息

【目的】LuxS/ai-2型密度感应系统存在于革兰氏阴性和阳性菌中,可产生用于细菌种间交流的通用自诱导信号分子ai-2(Autoinducer-2,ai-2),细菌许多生理功能都受此系统的调节。本研究开展对禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)自诱导信号分子ai-2的检测和建立体外合成、定量的方法,为进一步研究APEC的ai-2调控作用奠定基础。【方法】利用哈维弧菌BB170(Vibrio harveyi BB170)开展对APEC ai-2的检测;利用表达、纯化的LuxS和Pfs在体外催化S-腺苷同型半胱氨酸(Sadenosylhomocysteine,SAH),进行ai-2的体外合成。【结果】APEC能产生自诱导信号分子ai-2;成功表达可用于ai-2合成的可溶性重组蛋白LuxS和Pfs;纯化的重组蛋白LuxS和Pfs与SAH同时作用后,合成了浓度为300μmol/L的ai-2;运用哈维弧菌BB170对合成的ai-2活性检测表明,其活性是阴性对照的700倍。【结论】APEC存在LuxS/ai-2型密度感应系统,APEC的LuxS和Pfs可以在体外催化SAH生成有活性的ai-2分子。本研究为进一步研究APEC的ai-2的调控作用奠定基础。

关键词：禽致病性大肠杆菌密度感应系统信号分子ai-2 LuxS

基于ai-2介导的类植物乳杆菌生物被膜态与浮游态抗胁迫能力比较与分析

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食品科学 2017年第22期38卷 41-47页

作者：刘蕾武瑞赟李军李平兰北京食品营养与人类健康高精尖创新中心、中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083 内蒙古大学生命科学学院内蒙古呼和浩特010021

采用平板活菌计数法比较被膜态及浮游态的类植物乳杆菌L-ZS9经热处理、酸处理、胆盐处理后的存活率,结果表明被膜态菌体具有更强的抗胁迫能力;通过实时荧光定量聚合酶链式反应的方法比较被膜态及浮游态菌株L-ZS9的胁迫相关基因atpβ、at... 详细信息

采用平板活菌计数法比较被膜态及浮游态的类植物乳杆菌L-ZS9经热处理、酸处理、胆盐处理后的存活率,结果表明被膜态菌体具有更强的抗胁迫能力;通过实时荧光定量聚合酶链式反应的方法比较被膜态及浮游态菌株L-ZS9的胁迫相关基因atpβ、atpε、clp、psp C、ccpA及群体感应信号分子自诱导物(autoinducer 2,ai-2)合成关键基因lux S的转录水平,结果表明被膜态菌体的基因转录水平显著高于浮游态;通过报告菌株发光检测法比较被膜态及浮游态菌株上清液中ai-2的活性,结果表明被膜态菌体上清液中ai-2的活性显著高于浮游态;且外源信号分子ai-2可以调控基因atpβ、atpε、clp、ccpA、luxS的转录水平。结果说明生物被膜不仅可以提供物理防御作用,而且其细胞个体的基因转录水平与浮游态也有所不同,且群体感应系统在被膜的形成与调控中发挥着重要作用。本研究为开发高活力益生菌功能食品提供了新的思路和理论基础。

关键词：类植物乳杆菌生物被膜抗胁迫能力信号分子ai-2 转录水平

密度感应系统对弗氏志贺菌生长竞争能力的影响

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遗传 2015年第5期37卷 487-493页

作者：徐苹杨晶陆丽兰冯尔玲王恒樑卢瑛朱力上海海洋大学食品学院上海201306 军事医学科学院生物工程研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

密度感应系统调节细菌应答反应的发生,这些应答反应与细胞密度有关。通过对比大肠杆菌(Escherichia coli)和志贺氏菌(Shigella spp.)的序列发现,志贺菌属密度感应系统操纵子普遍存在丢失或突变。为研究其密度感应系统的功能,文章利用哈... 详细信息

密度感应系统调节细菌应答反应的发生,这些应答反应与细胞密度有关。通过对比大肠杆菌(Escherichia coli)和志贺氏菌(Shigella spp.)的序列发现,志贺菌属密度感应系统操纵子普遍存在丢失或突变。为研究其密度感应系统的功能,文章利用哈氏弧菌(Vibrio harveyi)BB170作为指示菌,检测弗氏志贺菌(Shigella flexneri)密度感应系统信号分子ai-2,证明其可以分泌有活性的ai-2;其次,采用Golden Gate克隆法将大肠杆菌MG1655的密度感应系统基因克隆至弗氏志贺菌301中,获得密度感应系统回复株301。通过菌落计数表明,在混合培养条件下,密度感应系统基因回复株301比野生株301存在生长优势;通过双向电泳初步比较分析表明,密度感应系统基因可以在志贺菌中表达,并鉴定到了其他一些与应激反应相关的差异表达蛋白,如Hsp60、Gro EL、Sod B。

关键词：弗氏志贺菌密度感应系统信号分子ai-2 比较蛋白质组学

布鲁菌半胱氨酸水解酶在甲硫氨酸循环中的催化活性研究

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南京农业大学学报 2017年第4期40卷 697-702页

作者：徐达吴小卡荆雅玮左佳坤米荣升黄燕陈兆国王成明韩先干中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 扬州大学兽医学院江苏扬州225009 奥本大学兽医学院美国阿拉巴马州368495519

[目的]细菌的sah H基因编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(Sah H),该酶参与细菌的甲硫氨酸循环(AMC),调控细菌的多种生理功能。[方法]通过构建重组表达质粒p ET28a-Bru-sah H和p ET28a-Pse-sah H,分别表达布鲁菌(Brucella abortus)S2308株... 详细信息

[目的]细菌的sah H基因编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(Sah H),该酶参与细菌的甲硫氨酸循环(AMC),调控细菌的多种生理功能。[方法]通过构建重组表达质粒p ET28a-Bru-sah H和p ET28a-Pse-sah H,分别表达布鲁菌(Brucella abortus)S2308株和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1株的Sah H重组蛋白Bru-Sah H和Pse-Sah H。将纯化后的Bru-Sah H、Pse-Sah H以及我们前期表达纯化的禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)的Pfs和Lux S蛋白,分别在体外催化S-腺苷同型半胱氨酸(SAH),通过对产物同型半胱氨酸(HCY)的浓度测定,评价不同重组蛋白的催化活性,并对催化底物时产生的自诱导分子2(ai-2)活性进行检测。[结果]Bru-Sah H和Pse-Sah H分别催化1 mmol·L-1SAH生成38和47μmol·L-1HCY,而APEC的Pfs和Lux S蛋白能催化相同浓度的SAH产生401μmol·L-1HCY。运用哈维弧菌BB170检测上述底物的ai-2活性,结果表明只有同时采用AEPC的Pfs和Lux S蛋白催化SAH,才能形成有活性的ai-2分子,而Bru-Sah H和Pce-Sah H均不能催化SAH形成活性ai-2分子。[结论]Bru-Sah H能催化SAH生成HCY,为进一步研究sah H在布鲁菌感染过程中的作用提供依据。

关键词：布鲁菌甲硫氨酸循环 S-腺苷同型半胱氨酸水解酶催化活性信号分子ai-2

S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（SAHN）对大肠杆菌群感效应的调控研究

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S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（SAHN）对大肠杆菌群感效应的调控研究

作者：李超济南大学

学位级别：硕士

在感染病领域,耐药细菌的感染是目前全球关注的重要问题之一。现阶段采取的相应策略主要有:(1)通过合理使用抗生素以降低细菌耐药的变异速度;(2)探讨新的抑菌生化途径,研发新型的抗菌药物,使之用于对抗耐药菌。以甲基化修饰为途径,进而... 详细信息

在感染病领域,耐药细菌的感染是目前全球关注的重要问题之一。现阶段采取的相应策略主要有:(1)通过合理使用抗生素以降低细菌耐药的变异速度;(2)探讨新的抑菌生化途径,研发新型的抗菌药物,使之用于对抗耐药菌。以甲基化修饰为途径,进而使抗菌药物靶点的结构发生改变,这是常见致病菌的一种重要耐药机制。S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)作为一种重要的酶参与甲基循环,对S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖的甲基转移反应产生的通用产物S-腺苷高半胱氨酸(SAH)进行裂解,并促使甲硫氨酸(Met)和腺嘌呤(Adenine)进行再生,进而产生通用群感效应信号分子ai-2。群感效应所产生的生物膜作为细菌生长分裂的一种重要的保护模式,能保证细菌在恶劣环境下可以生存,也会使细菌对抗抗生素的能力提高,生物膜的形成成为细菌耐药的重要机制之一,这也是大多数慢性传染性疾病难以控制的主要原因。首先,SAHN酶活性下降会造成菌体内S-腺苷高半胱氨酸的累积,作为SAM所依赖的甲基转移酶的有效反馈抑制剂,菌体内SAH的积累就会使甲基转移反应受到全面抑制,进而以影响基因表达调控和蛋白修饰的方式来降低病原菌的适应性,使细菌的生长和分裂得到抑制。其次,抑制SAHN酶蛋白会使群感效应信号分子的前体缺失,使病原菌无法顺利合成信号分子,可使细菌群感效应,如:病原菌毒力因子的表达、菌膜的形成等得到有效控制。综上,SAHN酶蛋白活性变化会对大肠杆菌生长分裂以及群感效应产生影响。由于哺乳动物细胞中并不存在这种核苷酶,因此,SAHN酶在致病菌中的功能分析和研究成为发展新型广谱杀菌剂的一种新思路。本论文以大肠杆菌的全基因组DNA做为模板,利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)的方法扩增目sahn基因,构建重组表达载体。以IPTG为诱导剂进行诱导表达,并通过Ni-NTA亲和层析对SAHN酶蛋白进行纯化。将纯化后的蛋白经除盐浓缩后用考马斯亮蓝法测其蛋白含量约为348μg/m L。并进一步建立了黄嘌呤氧化酶的酶偶联分析检测技术对SAHN酶蛋白进行了酶活性测定。通过设计梯度下pH及温度反应体系对SAHN酶蛋白酶促反应最佳pH及温度进行分析,实验表明SAHN在广泛的pH条件下均具有酶活性,并发现该蛋白热稳定性较差。最后通过比较SAHN酶蛋白在不同表达水平下,对其群感效应的表征信号分子ai-2合成量也是不同。在大肠杆菌生物膜实验中,发现SAHN酶蛋白在过量表达水平下,使大肠杆菌生物膜的生成量及致密性上升。在实验结果中可以发现,SAHN酶蛋白在过量表达下,会加强菌体的群感效应,从而为发展以SAHN为药物靶点的新型抗感染药物提供理论和实验上的依据和参考。

关键词： S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN) 生物膜群感效应信号分子ai-2

大肠杆菌S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（SAHN）的功能性研究及其药物虚拟筛选

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大肠杆菌S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（SAHN）的功能性研究及其药物虚...

作者：韩甜济南大学

学位级别：硕士

目前,在感染病领域由耐药细菌引起的疾病感染是全球正在关注的热点。对药物的作用靶点结构进行修饰可以通过甲基化过程来实现,这是致病菌一种重要的耐药机制。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)在细胞中是一种通用的甲基供体,在甲基循环中起着非常重... 详细信息

目前,在感染病领域由耐药细菌引起的疾病感染是全球正在关注的热点。对药物的作用靶点结构进行修饰可以通过甲基化过程来实现,这是致病菌一种重要的耐药机制。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)在细胞中是一种通用的甲基供体,在甲基循环中起着非常重要的作用,如果某些关键的蛋白质与SAM的生化代谢途径相关,那么此蛋白质有可能成为一种药物靶点。在甲基转移酶催化作用下,S-腺苷高半胱氨酸(SAH)由甲基供体SAM参与去甲基化反应生成。SAH在转甲基化反应过程是一种有效的竞争性抑制剂,对细胞内的核酸和蛋白质有强烈的毒性,能抑制它们的修饰过程。在哺乳动物细胞内,SAH在S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)作用下发生水解反应,只需要一步就生成产物高半胱氨酸和腺苷酸,而在大多数病原微生物的细胞内没有表达SAHH蛋白的能力,SAH只能是在S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)和S-核糖基高半胱氨酸酶(LuxS)两种酶的参与下发生催化分解反应,生成腺嘌呤和高半胱氨酸。另外,经甲基修饰的供体SAM发生甲基化反应后除生成SAH还能生成甲硫腺苷(MTA)。在很多致病性的病原微生物中,MTA在S-腺苷高半胱氨酸/甲硫腺苷核苷酶(SAHN)作用下发生分解反应,生成腺嘌呤和5′-甲硫核糖(MTR),MTR立即进入下一步反应,在5′-甲硫核糖激酶(MTR Kinase)作用下发生磷酸化反应,生成的产物是5′-甲硫核糖-1-磷酸(MTRP)。但是,在致病菌的宿主哺乳类等真核细胞内,MTA是通过不同的途径来进行反应的,在5′-甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)催化作用下生成MTRP和腺嘌呤。病原微生物和宿主细胞在是SAH代谢节点和MTA代谢节点的不同,使得在致病菌中特有的能分解SAH和MTA反应的SAHN核苷酶成为抗感染药物的一个具有潜力的分子靶标。本论文利用Red/ET同源重组法敲除大肠杆菌MG1655的sahn基因,通过同源重组双交换的方法用卡那霉素抗性基因取代基因组中整个sahn基因的编码序列。转入重组酶表达质粒以消除抗性筛选标记,得到保留单一LoxP位点的突变菌株△sahn。同时,本论文成功构建重组表达载体pET-28a-sahn。以IPTG作为诱导剂进行诱导表达,并通过Ni-NTA亲和层析对SAHN酶蛋白进行纯化。用考马斯亮蓝法测定经除盐浓缩后的蛋白含量约为368?g/m L,根据米氏方程双倒数法计算SAHN酶蛋白的酶促反应动力学参数Vmax和Km。实验研究还发现SAHN酶蛋白在不同的表达水平下,群感效应的表征信号分子ai-2和菌膜的形成均有所差异。最后,采用分子对接技术从小分子数据库中筛选到一种新型抑制剂,并模拟小分子抑制剂与受体SAHN酶蛋白的相互作用。小分子抑制剂与受体SAHN酶蛋白的相互作用是分子相互识别的过程,主要作用力包括氢键作用、静电作用、疏水作用、范德华力作用等。通过计算来预测两者间的模式结合亲和力,进行药物的虚拟筛选,从而为发展以SAHN为药物靶点的可行性提供理论和实验上的依据和参考。

关键词： S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN) 群感效应信号分子ai-2 生物膜药物虚拟筛选