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非洲猪瘟病毒VP73基因主要抗原表位区的融合原核表达

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中国生物工程杂志 2010年第2期30卷 60-65页

作者：李秋霞滕达童德文杨雅麟田子罡王建华西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 中国农业科学院饲料研究所基因工程室农业部饲料生物技术重点开放实验室北京100081

人工合成VP73基因全长序列,利用DNAstar软件确定其中抗原性较高的区域,利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物,通过PCR扩增得到243bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段(vp73l)。将该片段与表达载体pET-32a连接克隆至大肠杆菌Escherichia co... 详细信息

人工合成VP73基因全长序列,利用DNAstar软件确定其中抗原性较高的区域,利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物,通过PCR扩增得到243bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段(vp73l)。将该片段与表达载体pET-32a连接克隆至大肠杆菌Escherichia coli(***)DH5α菌株,经测序、菌落PCR和酶切鉴定,选取VP73L基因正向插入,读码框正确的阳性克隆。构建重组质粒并转化BL21(DE3),经IPTG诱导,融合蛋白以可溶性形式在***21(DE3)高效表达,经His亲和层析柱得以纯化。Western blotting显示,该融合蛋白能与兔抗非洲猪瘟病毒VP73多克隆抗体发生特异性反应。所得结果为进一步研究:分离纯化该重组融合蛋白;确证目标抗原蛋白VP73L免疫原性及其特异性,进而达到建立非洲猪瘟病毒的免疫检测方法奠定了必要的材料与技术基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 VP73基因主要抗原表位区表达

单纯疱疹病毒1型糖蛋白D主要抗原表位区的表达、纯化及鉴定

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基础医学与临床 2013年第3期33卷 350-355页

作者：刘红刘宾和骁赵晓涛北京大学人民医院检验科北京100044 北京大学工学院生物医学工程系北京100871

目的原核表达单纯疱疹病毒1型(HSV-1)糖蛋白D(gD)主要抗原表位区,纯化融合表达蛋白并对其进行鉴定。方法用Lasergene7.0中Protean软件对HSV-1 gD氨基酸序列进行抗原表位预测和分析,筛选出gD主要抗原表位区(gD MED),人工合成该区域cDNA序... 详细信息

目的原核表达单纯疱疹病毒1型(HSV-1)糖蛋白D(gD)主要抗原表位区,纯化融合表达蛋白并对其进行鉴定。方法用Lasergene7.0中Protean软件对HSV-1 gD氨基酸序列进行抗原表位预测和分析,筛选出gD主要抗原表位区(gD MED),人工合成该区域cDNA序列,构建原核表达载体pET-GST-gD MED;将重组质粒转化大肠杆菌(***)BL21(DE3)pLysS,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过***纯化试剂盒对gDMED融合蛋白进行纯化;Western blot对gD MED融合蛋白的免疫活性进行分析。结果 HSV-1 gD在266～394区域富含抗原表位,人工合成了该区域的cDNA序列,并成功构建了原核表达载体pET-GST-gD MED;gD MED融合蛋白主要以可溶形式表达,分子质量约为45 ku,纯度能达95%;Western blot结果显示,gD MED融合蛋白能与感染HSV-1患者的血清发生特异结合。结论成功表达和纯化了具有良好抗原性的HSV-1 gD MED融合蛋白,为HSV免疫诊断试剂盒和基因工程疫苗的研制提供了依据。

关键词：单纯疱疹病毒1型糖蛋白D 主要抗原表位区原核表达

猪细小病毒NS1蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

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中国兽医学报 2009年第8期29卷 964-967,985页

作者：冉旭华闻晓波孟凡周恩民黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

通过分子生物学软件对GenBank中发表的猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)中国株NS1蛋白的氨基酸序列进行分析,确定了主要抗原表位区域,针对此区域设计了1对特异性引物。通过PCR方法扩增出长度为843bp的基因片段,将此片段克隆到原核表... 详细信息

通过分子生物学软件对GenBank中发表的猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)中国株NS1蛋白的氨基酸序列进行分析,确定了主要抗原表位区域,针对此区域设计了1对特异性引物。通过PCR方法扩增出长度为843bp的基因片段,将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,构建了原核表达载体pET30a-NS1,实现了PPVNS1蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中的高效表达。重组蛋白相对分子质量约为43 000,与预期相符。Western-blot试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性。以纯化的该蛋白作为包被抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为2 mg/L,一抗的最佳稀释倍数为1∶100,阳性标准为:待检血清D450≥0.36,且待检血清D450/阴性血清D450>2,作为阴阳性临界值,初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。用该方法对临床血清样本进行检测,间接ELISA判定为阳性的60份血清,经Western-blot试验只有45份为阳性。随机抽取100份猪血清样品与商品化试剂盒检测结果对比,符合率为96%,表明所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疾病的鉴别诊断奠定了基础。

关键词：猪细小病毒 NS1蛋白主要抗原表位区表达间接ELISA

猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端主要抗原表位区的原核表达

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动物医学进展 2010年第1期31卷 24-27页

作者：冉旭华闻晓波王密李冬野侯喜林黑龙江八一农垦大学动物科技学院预防兽医学省重点实验室黑龙江大庆163319

利用分子生物学软件分析GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列,确定了其C端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,RT-PCR扩增该区域,并将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,命名为pET30a-ORF2C,然后... 详细信息

利用分子生物学软件分析GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列,确定了其C端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,RT-PCR扩增该区域,并将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,命名为pET30a-ORF2C,然后转化大肠埃希菌BL21感受态细胞,1.0 mmol/L IPTG 37℃诱导表达。结果表明,RT-PCR扩增得到301 bp的片段,重组蛋白大小约为18 ku,与预期大小相符。Western blot分析表明,该蛋白与阳性血清发生特异性反应,为进一步利用其建立诊断方法奠定了基础。

关键词：猪戊型肝炎病毒 ORF2 主要抗原表位区表达

猪伪狂犬病毒Guizhou-DY株gE基因主要抗原表位区的克隆及序列分析

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黑龙江畜牧兽医 2013年第9期 106-108页

作者：罗险峰郝飞汤德元李春燕曾智勇甘振磊王凤刘建王洪光贵州省动物疫病预防控制中心贵阳550008 贵州大学动物科学学院贵阳550025

为了研究猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因主要抗原表位区是否可以进行原核表达,试验根据GenBank中发表的PRV GDSH株(EF552427)和Guizhou-DY株(JX417716)的基因序列,设计1对特异性引物,采用PCR扩增Guizhou-DY株gE基因主要抗原表位区,并进行克隆... 详细信息

为了研究猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因主要抗原表位区是否可以进行原核表达,试验根据GenBank中发表的PRV GDSH株(EF552427)和Guizhou-DY株(JX417716)的基因序列,设计1对特异性引物,采用PCR扩增Guizhou-DY株gE基因主要抗原表位区,并进行克隆与序列分析。结果表明:Guizhou-DY株gE基因主要抗原表位区全长为636 bp,与韩国Yangsan株和国内GDSH株核苷酸同源性较高,分别为99.4%和99.2%;与韩国Yangsan株和国内GDSH株、HNJZ株氨基酸同源性较高,均为98.6%。说明该分离株与韩国Yangsan株和国内GDSH株具有较近的亲缘关系。

关键词：猪伪狂犬病毒(PRV) Guizhou—DY株 gE基因主要抗原表位区克隆序列分析

猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端主要抗原表位区的原核表达

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中国畜牧兽医 2010年第1期37卷 51-54页

作者：冉旭华闻晓波王密李冬野侯喜林黑龙江八一农垦大学动物科技学院预防兽医学省重点实验室大庆163319

用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端的主要抗原表位区。通过对GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列进行分析,确定了其N端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了1对特异性引物,RT-PCR扩增该区段,并将此片段... 详细信息

用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端的主要抗原表位区。通过对GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列进行分析,确定了其N端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了1对特异性引物,RT-PCR扩增该区段,并将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,命名为pET30a-ORF2N,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,1.0 mmol/LIPTG37℃诱导表达。RT-PCR扩增得到424 bp的片段,重组蛋白大小约为21.8 ku,与预期大小相符。West-ern blotting分析结果表明,该蛋白能与阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有生物学活性。猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端主要抗原表位区在大肠杆菌中成功表达,具有一定的反应原性,为进一步用其建立诊断方法奠定基础。

关键词：猪戊型肝炎病毒 ORF2 主要抗原表位区表达

伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

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伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方...

作者：李宇四川农业大学

学位级别：硕士

本研究以猪伪狂犬病病毒(PRV)四川分离SL株为材料,分子克隆gE基因全序列并进行生物信息学分析,选择gE基因主要抗原表位区片段进行原核表达载体构建、原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立。 ***基因的分子克隆与生物信息学分析参照Ge... 详细信息

本研究以猪伪狂犬病病毒(PRV)四川分离SL株为材料,分子克隆gE基因全序列并进行生物信息学分析,选择gE基因主要抗原表位区片段进行原核表达载体构建、原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立。 ***基因的分子克隆与生物信息学分析参照GenBank中登录号为NC06151的gE基因序列,以四川分离的PRV SL株为材料,TA克隆到,pMD19T-Simple Vector,构建重组克隆质粒pMD-gE,经酶切鉴定和序列测定,克隆出长为1964 bp的基因片段,其中包含1734 bp的gE基因完整阅读框,编码578个氨基酸。将测序结果及推导的氨基酸序列与国内外不同来源的10个毒株进行生物学信息分析,核苷酸序列同源性在97.5%～100.0%之间,氨基酸同源性在94.8%～99.8%之间,不同PRV毒株间gE基因在核苷酸水平和氨基酸水平上是高度保守的。分析得知,gE基因密码子中G、C出现频率较高,分别占了40%和30%,出现频率最高的四个密码子为GGG、GAC、CTG和CGC,且GC3s含量达96.89%,证明该基因对于G、C具有明显的偏爱性;二级结构分析,主要以转角和无规卷曲为主;通过疏水性分析和跨膜区预测,gE蛋白包含两个疏水区,第一个疏水区(3～25位氨基酸残基处)为信号肽,第二个疏水区(429-452位氨基酸残基处)跨膜一次,N端位于膜外侧,C端位于膜内侧;抗原位点预测分析,gE基因的抗原表位大部分位于N端300个氨基酸内。 ***基因主要抗原表位区原核表达载体构建及活性检测以pMD-gE重组质粒为模板,设计一对引物,PCR扩增出gE基因主要抗原表位区(mgE)(包含52-263氨基酸残基片段),TA克隆到]pMD19 T-Simple Vector载体上,构建克隆重组质粒pMD-mgE,将阳性克隆菌送公司测序,测序结果与模板中对应序列完全一致。用EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶定向克隆到]pET-32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET-mgE,然后转化高效表达菌*** Rosetta TM(DE3)进行表达研究。经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测显示,在约42 Ku处出现一条特异带,Western-Blot检测显示表达的融合目的蛋白具有特异的反应原性。 ***基因表达蛋白的纯化及其ELISA检测方法的初步建立对诱导表达后以包涵体形式存在的mgE重组蛋白进行纯化,作为包被抗原,并对抗原的包被,作用时间及底物选择等条件进行优化,最后通过特异性试验、重复性试验、阻断试验以及和与标准试剂盒对比等方法检验已建立的ELISA方法效果,初步建立了猪伪狂犬病病毒抗体的gE-ELISA检测方法。结果表明,ELISA最佳工作条件为：重组抗原最适包被质量浓度为8.3ug/mL,最适包被条件为4℃过夜,血清稀释度为1：40,血清和酶标二抗的反应时间分别为37℃下90 min和60 min,反应底物用TMB溶液,37℃显色10 min;统计学分析后确定阴阳性的临界值为0.32。各项检测试验的结果表明此方法特异性强、重复性好、敏感度较高;将建立的ELISA方法与美国IDEXX公司PRV抗体检测试剂盒相比较,其相对特异性和敏感性分别为98.1%和91.5%,符合率达到90.0%,检测结果无显著性差异。本试验克隆并表达了PRV gE基因中抗原集中的一个基因片段,初步建立了间接ELISA检测方法。从生物信息学、分子生物学、免疫原性等方面对gE基因进行了研究,为PRV的深入研究提供了参考。

关键词：伪狂犬病病毒 gE基因主要抗原表位区生物信息学分析原核表达间接ELISA

猪细小病毒GZ分离株NS1基因主要抗原表位区原核表达研究

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山地农业生物学报 2013年第5期32卷 397-402页

作者：刘建汤德元姜德荣王洪光李达贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025

根据GenBank登录的猪细小病毒NADL-2株和China株NS1基因序列设计1对特异性引物,对贵州大学动物生物技术实验中心分离的猪细小病毒GZ株接种ST细胞传代培养后,提取病毒DNA,进行PCR扩增PPV NS1基因主要抗原表位区,克隆后测序,随后将该基因... 详细信息

根据GenBank登录的猪细小病毒NADL-2株和China株NS1基因序列设计1对特异性引物,对贵州大学动物生物技术实验中心分离的猪细小病毒GZ株接种ST细胞传代培养后,提取病毒DNA,进行PCR扩增PPV NS1基因主要抗原表位区,克隆后测序,随后将该基因亚克隆至pET-32a(+)载体,构建pET-32a-NS1重组质粒,转化得到重组菌,经IPTG诱导表达,通过亲和柱纯化并复性,制备重组蛋白。Western-blot检测发现,经诱导表达的NS1基因主要抗原表位区蛋白约为64 ku,与预测的大小一致,而且,重组蛋白在纯化复性后能被PPV阳性血清所识别,具有较好的反应原性。

关键词：猪细小病毒 NS1基因主要抗原表位区原核表达

猪细小病毒NS1蛋白主要抗原表位区的原核表达

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生物技术 2008年第2期18卷 18-20页

作者：冉旭华孟凡闻晓波单玉波周恩民黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 黑龙江省讷河市畜牧局黑龙江讷河161300

目的:用大肠杆菌表达猪细小病毒NS1基因的主要抗原表位区。方法:通过对GenBank发表的猪细小病毒(Porcine Par-vovirus,PPV)中国株非结构蛋白NS1的氨基酸序列分析,确定了其中抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,扩... 详细信息

目的:用大肠杆菌表达猪细小病毒NS1基因的主要抗原表位区。方法:通过对GenBank发表的猪细小病毒(Porcine Par-vovirus,PPV)中国株非结构蛋白NS1的氨基酸序列分析,确定了其中抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,扩增出包含NS1主要抗原表位区的843bp的片段。酶切后连接到原核表达载体pET30a(+)上,构建的原核表达载体pET30a-NS1s转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达。结果:重组蛋白大小约为43kD,与预期大小相符。Westernblot分析表明,该蛋白能与标准阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有生物学活性。结论:NS1蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性。可作为鉴别诊断抗原用于PPV的临床检测。

关键词：猪细小病毒 NS1蛋白主要抗原表位区表达