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氧化苦参碱对溃疡性结肠炎大鼠β-arrestin1/2相关信号转导通路的影响

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氧化苦参碱对溃疡性结肠炎大鼠β-arrestin1/2相关信号转导通路的...

作者：廖奕华中科技大学

学位级别：硕士

目的:研究β-arrestin1/2在溃疡性结肠炎（uclerative colitis,UC）发生机制中的作用,β2肾上腺素受体（β2AR）-β-arrestin2-NF-κB和δ阿片受体（DOR）-β-arrestin1-Bcl2信号转导通路是否参与UC发生的病理过程,氧化苦参碱是否通过... 详细信息

目的:研究β-arrestin1/2在溃疡性结肠炎（uclerative colitis,UC）发生机制中的作用,β2肾上腺素受体（β2AR）-β-arrestin2-NF-κB和δ阿片受体（DOR）-β-arrestin1-Bcl2信号转导通路是否参与UC发生的病理过程,氧化苦参碱是否通过干预β-arrestin1/2的表达及β2AR-β-arrestin2-NF-κB和DOR-β-arrestin1-Bcl-2信号转导通路减轻UC的临床表现和病理改变。方法:40只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、美沙拉嗪组和氧化苦参碱组4组,每组10只。正常对照组未造模,其余3组大鼠均采用TNBS造模诱导大鼠UC。其中氧化苦参碱组大鼠予苦参素（氧化苦参碱）注射液肌肉注射,美沙拉嗪组大鼠予美沙拉嗪混悬液灌胃,模型组和正常组大鼠均以3ml蒸馏水灌胃。实验中注意观察大鼠腹泻、便血症状。第7d,每组随机处死2只大鼠,比较各组结肠组织病理变化,取病变结肠组织石蜡包埋切片并HE染色,镜下观察各组结肠病理组织学改变。第16d禁食24h后处死大鼠,用免疫组化技术和Western免疫印迹技术检测①UC大鼠结肠组织和脾脏淋巴细胞β2AR、β-arrestin2和NF-κBp65表达的变化和②UC大鼠结肠组织和T淋巴细胞DOR、β-arrestin1和Bcl2表达变化。实验过程中正常对照组、模型组、美沙拉嗪组各有2只大鼠在灌胃中死亡,最后纳入统计为:正常对照组6只、模型组6只、美沙拉嗪组6只和氧化苦参碱组8只。结果:与正常对照组比较,模型组NF-κBp65表达水平显著上升（P＜0.01）,β2AR和β-arrestin2表达水平显著下降（P＜0.01）;与模型组比较,美沙拉嗪组和氧化苦参碱组NF-κBp65表达水平均显著下降（P＜0.01）,β2AR和β-arrestin2表达水平显著上升（P＜0.01）。与正常对照组相比,模型组DOR、β-arrestin1和Bcl2表达明显增高（P ＜0.01）。与模型组比较,美沙拉嗪组和氧化苦参碱组DOR、β-arrestin1、Bcl2表达均显著下降（P＜0.01）。结论:UC中β2AR和β-arrestin2表达下降,NF-κB表达上升,β-arrestin2对NF-κB活化的抑制作用减弱,NF-κB活性增强,是UC发生的重要病理机制,β2AR-β-arrestin2-NF-κB信号转导通路参与UC的病理机制,氧化苦参碱可以通过促进中β2AR和β-arrestin2的表达,抑制NF-κB的表达,减轻UC的临床表现和病理改变。 UC中DOR、β-arrestin1和Bcl-2表达上升,DOR-β-arrestin1-Bcl-2信号转导通路参与UC的发病机制,氧化苦参碱可以通过抑制DOR-β-arrestin1-Bcl-2信号转导通路减轻UC的临床表现和病理改变。

关键词： β2肾上腺素受体(β2AR) β-arrestin2 NF-κB δ阿片受体(DOR) β-arrestin1 Bcl2 CD4+T细胞溃疡性结肠炎(UC) 氧化苦参碱信号转导通路

CCK-8对甲基苯丙胺诱导神经元凋亡的作用及机制研究

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CCK-8对甲基苯丙胺诱导神经元凋亡的作用及机制研究

作者：张武华河北医科大学

学位级别：硕士

背景:甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)是一种中枢神经系统兴奋剂,长期滥用易对中枢神经系统产生毒性作用。神经元凋亡是METH发挥其毒性作用的机制之一。对于METH引起的神经毒性损伤目前尚无有效的治疗药物。八肽胆囊收缩素(octapeptid... 详细信息

背景:甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)是一种中枢神经系统兴奋剂,长期滥用易对中枢神经系统产生毒性作用。神经元凋亡是METH发挥其毒性作用的机制之一。对于METH引起的神经毒性损伤目前尚无有效的治疗药物。八肽胆囊收缩素(octapeptide cholecystokinin,CCK-8)是一种脑肠肽,我室近十年的研究发现CCK-8具有拮抗METH诱导的氧化应激和神经炎症作用,也对吗啡诱导的神经元凋亡具有保护作用。胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)受体是CCK-8在中枢和外周的作用靶点,有CCK1受体(CCK1 receptor,CCK1R)和CCK2受体(CCK2 receptor,CCK2R)两种亚型。我室在用CCK-8干预吗啡的研究中发现,CCK1R是低敏性受体,CCK2R为高敏性受体,即高剂量CCK-8可激活CCK1R发挥作用,而低剂量CCK-8可激活CCK2R发挥生物学功能。吗啡与METH的作用类型和性质不同,而CCK-8及其CCK受体亚型对METH诱导的神经元凋亡是否发挥保护作用尚未见报道。CCK受体属于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)。β-arrestin可作为GPCR的信号传感器,发挥抗凋亡或促凋亡的作用。β-arrestin在CCK-8对METH诱导神经元凋亡中机制如何目前也未见报道。目的:本研究旨在阐明CCK-8对METH诱导SH-SH5Y细胞凋亡的保护作用及机制,并进一步阐明β-arrestin2是否介导CCK-8抑制METH致SH-SH5Y细胞凋亡的偏向激动作用。理解CCK-8对METH神经毒性的作用机制将为防治METH滥用致神经损伤提供新思路。方法:应用Annexin-V-FITC/PI流式染色和Hoechst33258染色检测SH-SH5Y细胞凋亡率变化。Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达变化。慢病毒稳定转染构建HEK293-CCK1R细胞系和HEK293-CCK2R细胞系,以探讨不同CCK受体亚型在CCK-8抑制METH诱导神经元凋亡中的作用。脂质体转染小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲低SH-SH5Y细胞的β-arrestin2,进一步明确CCK-8发挥抗凋亡作用时β-arrestin2在CCK受体下游的作用。研究数据应用SPSS 21.0软件分析,结果表示为均数±标准误(mean±S.E.M.),各组间均数比较行单因素方差分析(one-way ANOVA),采用最小显著差异t检验(即LSD-t检验)进行两两比较,以Pβ-arrestin2的SH-SY5Y细胞中,CCK-8预处理对METH诱导SH-SY5Y的Bax、Cleaved Caspase3蛋白表达上调以及Bax/Bcl2增加均没有明显影响。提示β-arrestin2可能介导了CCK-8保护METH诱导神经元凋亡的偏向激动作用。结论:***-8对METH诱导SH-SY5Y细胞凋亡发挥保护作用。***-8可能通过与CCK2R结合发挥对METH诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用;β-arrestin2可能在这一保护过程中介导偏向激动作用。

关键词：甲基苯丙胺八肽胆囊收缩素神经元凋亡神经保护 β-arrestin2

交感神经调控细胞衰老在肾脏纤维化中的作用及机制

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交感神经调控细胞衰老在肾脏纤维化中的作用及机制

作者：黎倩华中科技大学

学位级别：硕士

目的交感神经激活与慢性肾脏病(CKD)进展有关,慢性衰老细胞在老化和损伤的肾脏中积累,导致肾损伤后进行性纤维化。本研究主要探讨肾脏交感神经调控细胞衰老在肾脏纤维化中的作用及机制,为探索防治慢性肾脏病的新治疗靶点提供理论依据。... 详细信息

目的交感神经激活与慢性肾脏病(CKD)进展有关,慢性衰老细胞在老化和损伤的肾脏中积累,导致肾损伤后进行性纤维化。本研究主要探讨肾脏交感神经调控细胞衰老在肾脏纤维化中的作用及机制,为探索防治慢性肾脏病的新治疗靶点提供理论依据。方法首先我们建立了肾脏去神经动物模型,并在去神经成功2天后构建单侧输尿管梗阻(UUO)和单侧肾脏缺血再灌注损伤(UIRI)小鼠模型,以探讨肾交感神经与CKD以及与肾脏衰老的关系。其次,我们使用交感神经递质去甲肾上腺素(NE)在体外刺激肾小管上皮细胞,观察其衰老相关蛋白和衰老相关分泌表型的变化,进一步探讨交感神经能否调控细胞衰老。此外,我们使用各种选择性肾上腺素能受体(AR)拮抗剂和si RNA预处理肾小管上皮细胞,以探讨交感神经调控细胞衰老的具体机制。结果在UUO和UIRI小鼠模型中,肾脏间质纤维化和衰老加重,阻断肾交感神经延缓肾间质纤维化的同时改善肾脏衰老。在体外实验中,交感神经递质NE促进肾小管上皮细胞衰老,并上调促纤维化生长因子水平。进一步的研究结果显示,α2-肾上腺素能受体(α2-AR)介导交感神经调控肾小管上皮细胞衰老,且其主要受体亚型为α2A-AR。此外,β-arrestin 2蛋白作为α2A-AR的下游靶点,通过线粒体损伤和NF-κB通路促进交感神经调控肾小管上皮细胞衰老。结论交感神经递质NE通过α2A-AR/β-arrestin 2/线粒体损伤以及NF-κB通路促进肾小管上皮细胞衰老,驱动肾脏纤维化发生发展。第一部分:交感神经激活促进肾小管上皮细胞衰老,驱动肾间质纤维化发生发展目的本部分内容主要探讨了交感神经激活和细胞衰老在肾脏间质纤维化中的作用,以及交感神经激活在细胞衰老过程中发挥的效应,阐述了交感神经、细胞衰老和肾脏间质纤维化三者之间的联系,为从神经调控和细胞衰老的角度防治肾间质纤维化提供实验支持。方法首先,我们成功建立肾脏去神经动物模型2天后,再构建单侧输尿管梗阻(UUO)和单侧肾脏缺血再灌注损伤(UIRI)小鼠模型,以探讨肾交感神经与肾小管间质纤维化以及与肾脏衰老的关系。其次,在体外实验中,我们使用交感神经递质去甲肾上腺素(NE)模拟交感神经激活状态来刺激肾小管上皮细胞,并以H2O2刺激作为阳性对照,进一步探讨交感神经与细胞衰老的关系。结果在UUO和UIRI小鼠模型中,肾脏间质纤维化和衰老加重,阻断肾交感神经延缓肾间质纤维化的同时改善肾脏衰老。在体外实验中,交感神经递质NE促进肾小管上皮细胞衰老,并上调促纤维化生长因子水平。结论交感神经激活促进肾小管上皮细胞衰老,释放衰老相关分泌表型(SASP)增加,通过旁分泌作用招募炎症细胞,增加炎症,且上调促纤维化生长因子和基质合成分子,促进肾脏间质纤维化的发生发展。第二部分:α2-肾上腺素能受体(α2-AR)介导交感神经调控肾小管上皮细胞衰老,其主要受体亚型是α2A-AR目的本部分内容主要为了明确交感神经激活后,交感神经递质去甲肾上腺素(NE)通过哪一种具体的肾上腺素能受体(AR)进行信号转导,进而调控肾小管上皮细胞衰老,为挖掘交感神经调控细胞衰老这一现象背后的机制提供实验证据。方法首先,在体外实验中,我们使用交感神经递质去甲肾上腺素(NE)刺激肾小管上皮细胞,检测各个AR的表达情况。然后在此基础上使用几种选择性AR拮抗剂(如β2-AR拮抗剂Butoxamine和ICI118551、α2-AR拮抗剂Atipamezole、α2A-AR拮抗剂BRL44408、α2B-AR拮抗剂Imiloxan以及α2C-AR拮抗剂JP1302)分别在不同浓度下预处理肾小管上皮细胞,以探讨交感神经调控细胞衰老的下游途径。结果五种AR在肾小管上皮细胞中均有表达,但表达量最高的为α2-AR和β2-AR。与Control组相比,NE刺激后衰老相关蛋白和衰老相关分泌表型表达增加,而与NE刺激组相比,只有α2-AR拮抗剂Atipamezole预处理组和α2A-AR拮抗剂BRL44408预处理组的细胞衰老情况被逆转,而Butoxamine和ICI118551(β2-AR拮抗剂)、Imiloxan(α2B-AR拮抗剂)以及JP1302(α2C-AR拮抗剂)预处理后均没有改善NE促进肾小管上皮细胞衰老的情况。结论α2-肾上腺素能受体(α2-AR)介导交感神经调控肾小管上皮细胞衰老,且其主要受体亚型为α2A-AR。第三部分:β-arrestin 2蛋白作为α2A-AR的下游靶点,通过线粒体损伤和NF-κB信号通路促进交感神经调控肾小管上皮细胞衰老目的本部分内容探讨了交感神经激活,交感神经递质去甲肾上腺素(NE)作用于α2A-AR后,其下游机制是什么,从更深层次阐明交感神经调控细胞衰老潜在的机制,也为线粒体功能障碍在CKD进展中的作用提供更全面的实验证据。方法首先,我们设计了3条si

关键词：肾脏交感神经激活肾脏纤维化肾小管上皮细胞衰老线粒体交感神经激活去甲肾上腺素肾上腺素能受体 β-arrestin2 NF-κB

GPR120通过抑制炎症反应和细胞凋亡保护缺血性脑损伤

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GPR120通过抑制炎症反应和细胞凋亡保护缺血性脑损伤

作者：任志萍山东大学

学位级别：硕士

[研究背景]缺血性脑卒中约占脑卒中的77%,因其高发病率,高致残率成为世界上第二大死亡原因,严重威胁中老年人的健康和生活。大脑中动脉栓塞(MCAO)是引发脑缺血最主要的原因,导致了 40%-80%的高死亡率。到目前为止,除了溶栓治疗以外,还... 详细信息

[研究背景]缺血性脑卒中约占脑卒中的77%,因其高发病率,高致残率成为世界上第二大死亡原因,严重威胁中老年人的健康和生活。大脑中动脉栓塞(MCAO)是引发脑缺血最主要的原因,导致了 40%-80%的高死亡率。到目前为止,除了溶栓治疗以外,还没有发现更有效的治疗脑缺血的方法。已证实炎症反应以及细胞凋亡在脑卒中的病理进程发挥重要的作用。因此,探究具有抗炎以及抗凋亡作用的药物作用靶点对缺血性脑卒中的治疗具有重要的理论意义和实际应用价值。G蛋白偶联受体(GPCRs)是最大的膜蛋白受体家族,可以调节机体内多种生理学进程,并且是40%药物的作用靶标。然而,现今还有接近100种GPCRs被归类为“孤儿”受体,其中包括GPR120。最近发现GPR120可以被长链不饱和脂肪酸激活,特别是ω-3游离脂肪酸,包含DHA和EPA。研究表明,ω-3游离脂肪酸激活GPR120,其可与β-arrestin2结合,发挥抗炎作用。另外,激活GPR120也可以通过调控PI3K/AKT或ERK信号通路发挥抗凋亡作用。但迄今为止,对于GPR120在缺血性脑血管疾病的作用以及机制尚无报道。[研究目的]本课题利用小鼠MCAO模型以及体外糖氧剥夺(OGD)模型探讨GPR120在缺血性脑损伤中的作用及机制。[研究方法]1.确定GPR120在脑缺血后的表达及其细胞定位。1.1 MCAO建立小鼠脑缺血模型,分别于缺血12 h,24 h,48 h,72 h取小鼠缺血侧大脑皮层缺血半暗带区域组织,利用Western b]ot和real-time PCR分别检测GPR120的蛋白及mRNA的表达水平;1.2免疫荧光双标方法检测GPR120在缺血侧大脑皮层中的表达以及细胞定位情况;1.3体外培养小胶质细胞系BV2细胞及神经细胞系PC12细胞,建立OGD模型,分别于OGD2 h,复氧2 h,6 h,12 h,24 h后,检测GPR120在两种细胞中蛋白及mRNA的表达水平。2.体外探究在小胶质细胞中GPR120对OGD诱导的炎症反应的调控。利用 GPR120 siRNA、β-arrestin2 shRNA 分别基因沉默 BV2 细胞的 GPR120、β-arrestin2,DHA激活GPR120,OGD损伤后,观察及检测:2.1 Western blot 和 real-time PCR 检测 3 组 GPR120-specific siRNA 的干扰效率;2.2 Western blot检测JNK和p38的磷酸化水平,COX2的蛋白水平变化;2.3 Real time PCR 检测炎症因子 IL-6,TNFα,IL-1β 的 mRNA 水平变化;2.4 ELISA法检测培养基中IL-1β的含量变化;2.5 Co-IP法检测GPR120与β-arrestin2的结合情况。3.体外探讨GPR120对OGD诱导的PC12细胞凋亡的调控作用及机制对正常及GPR120基因沉默PC12细胞建立OGD模型,观察及检测:3.1 Western blot检测GPR120 siRNA在PC12细胞中的干扰效率;3.2 Real-time PCR 检测炎症因子 IL-6,IL-1β 的 mRNA 水平;3.3 Flow cytometry检测细胞凋亡,CCK8法检测细胞存活率;3.4 Western blot检测AKT和ERK的磷酸化水平;3.5 利用 LY294002 或 U0126 分别抑制 PI3K/AKT 或 ERK 通路,Western blot 检测Bax,Bcl-2的蛋白水平。4.利用MCAO小鼠模型明确GPR120在缺血性脑损伤中的作用及机制。应用脑立体定位仪,向小鼠左侧大脑皮层双定点注射腺相关病毒(AAV)-shGPR120 或 AAV-Gfp,200mg/kg DHA 灌胃,每天一次,2 周后建立 MCAO模型,24 h后观察并检测:4.1 AAV定位注射3周后,real-time PCR检测AAV-shGPR120在大脑皮层中的基因沉默效率;4.2对小鼠进行神经功能学评分以及TTC染色计算其梗死面积;4.3 Western blot检测小鼠缺血侧皮层半暗带JNK和p38的磷酸化水平及COX2蛋白表达变化;4.4微量样本多指标流式蛋白定量技术(CBA)检测小鼠大脑皮层内炎症因子含量变化;4.5 Western blot检测小鼠缺血侧皮层半暗带Bax,Bcl-2蛋白水平。4.6 TUNEL染色检测凋亡细胞数目。[研究结果]1.在MCAO模型中,在小鼠的大脑皮层半暗带GPR120的蛋白及mRNA的水平明显升高。通过免疫荧光双标发现,在正常组织GPR120主要分布在小胶质细胞中,星形胶质细胞、神经元中含量较低,但是脑缺血后可以明显上调小胶质细胞和神经元中GPR120的表达。此外,体外实验也证实小

关键词：脑缺血 GPR120 炎症细胞凋亡 β-arrestin2

MDM2-β-arrestin 2在缺血-再灌注诱发肾内皮细胞AT1R表达异常中的作用机制

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MDM2-β-arrestin 2在缺血-再灌注诱发肾内皮细胞AT1R表达异常中...

作者：徐子昱华中科技大学

学位级别：硕士

目的:供肾获取、保存与分配中的(热/冷)缺血与血管吻合后血供的再恢复常导致移植肾缺血-再灌注(Ischemia-Reperfusion,I/R)损伤。I/R所致微血管内皮细胞损伤是启动抗体介导排斥反应(Antibody Mediated Rejection,ABMR)的关键事件,血管... 详细信息

目的:供肾获取、保存与分配中的(热/冷)缺血与血管吻合后血供的再恢复常导致移植肾缺血-再灌注(Ischemia-Reperfusion,I/R)损伤。I/R所致微血管内皮细胞损伤是启动抗体介导排斥反应(Antibody Mediated Rejection,ABMR)的关键事件,血管紧张素Ⅱ1型受体(Angiotensin II type 1 Receptor,AT1R)介导的ABMR是影响移植肾预后的待解难题。既往研究证明,E3泛素连接酶MDM2在I/R状态下加速内皮细胞表面AT1R的胞吞,而直接调控AT1R胞吞的β-arrestin 2受MDM2的正向调控。本研究旨在探讨MDM2-β-arrestin 2对AT1R的调控作用与机制,为防控I/R诱导的ABMR提供针对性的策略。方法:(1)C57BL/6小鼠夹闭双侧肾动脉30分钟,再灌注3天,建立缺血-再灌注动物模型。(2)C57BL/6小鼠双侧肾脏皮质多点注射AAV9型腺相关病毒(每侧4×10)诱导MDM2过表达,或注射等量空载病毒,4周后建立缺血-再灌注动物模型。(3)体外培养的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)和人肾小球内皮细胞(Human Renal Glomerular Endothelial Cells,HRGECs)氧糖剥夺(Oxygen Glucose Deprivation,OGD)1小时,复氧12小时,建立缺氧-复氧(Hypoxia–Reoxygenation,H/R)细胞模型。(4)在体外培养的内皮细胞中使用Neofect转染MDM2过表达质粒诱导MDM2过表达,48小时后建立缺氧-复氧细胞模型。(5)转染MDM2过表达质粒的内皮细胞与β-arrestin 2抑制剂Bosentan(20μM)或胞吞抑制剂Barbadin(100μM)共孵育,30分钟后建立缺氧-复氧细胞模型。(6)收集小鼠血标本检测生化指标尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)和肌酐(Serum Creatinine,SCr)水平。(7)小鼠肾组织石蜡切片进行苏木素-伊红染色(Hematoxylin-Eosin Staining,HE)观察其肾脏病理变化。(8)免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)和免疫荧光法(Immunofluorescence,IF)检测小鼠肾组织MDM2、β-arrestin 2、AT1R以及内皮细胞功能标志表达变化。(9)免疫荧光法检测体外培养的内皮细胞MDM2、β-arrestin 2以及胞膜AT1R的表达变化。(10)使用Thermo Scientific公司货号89842的胞膜提取试剂盒按照说明书流程提取内皮细胞胞膜蛋白用于后续Western blot检测。(11)提取小鼠肾组织蛋白和内皮细胞蛋白,采用免疫印迹法(Western Blot,WB)检测细胞内MDM2、β-arrestin 2、AT1R及内皮细胞功能标志物表达变化。结果:(1)I/R小鼠血清尿素氮和肌酐水平的升高伴有明显的小鼠肾脏病理学损害及内皮细胞功能障碍。(2)I/R小鼠肾组织MDM2、β-arrestin 2表达下降,伴随AT1R的表达升高。(3)缺氧-复氧的内皮细胞中,MDM2、β-arrestin 2表达下调,伴随细胞总体及胞膜AT1R的表达增加。(4)使用AAV9型腺相关病毒上调MDM2表达的I/R小鼠,其血清尿素氮和肌酐水平升高、肾脏病理学损害及内皮功能障碍得到改善;下调的β-arrestin 2表达被逆转;AT1R表达升高得到抑制。(5)转染MDM2过表达质粒的内皮细胞中,缺氧-复氧引起的β-arrestin 2表达下降被逆转,AT1R在胞膜的表达升高被抑制。(6)转染MDM2过表达质粒的内皮细胞与β-arrestin 2抑制剂Bosentan共孵育30分钟后建立缺氧-复氧模型,MDM2下调胞膜AT1R表达的作用被抑制。(7)转染MDM2过表达质粒的内皮细胞与抑制β-arrestin2-AP2介导的内吞作用的药物Barbadin共孵育30分钟后建立缺氧-复氧模型,MDM2下调胞膜AT1R表达的作用被抑制。结论:缺血-再灌注引起肾脏内皮细胞总体及胞膜AT1R表达上调,导致内皮细胞功能障碍,其作用机制可能是通过MDM2-β-arrestin 2调节clathrin-AP2依赖的AT1R的内吞。

关键词：缺血-再灌注损伤内皮细胞胞吞 MDM2 β-arrestin2 AT1R

俞氏清热活血方中药灌肠对溃疡性结肠炎β-arrestin 2相关蛋白表达的影响

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俞氏清热活血方中药灌肠对溃疡性结肠炎β-arrestin 2相关蛋白表...

作者：杨一天浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的通过给SD大鼠灌肠三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇建立溃疡性结肠炎的大鼠模型,观察清热活血方对溃疡性结肠炎模型大鼠炎症损伤和β-arrestin 2相关蛋白表达的影响,探讨溃疡性结肠炎黏膜修复和防治的可能作用机制。方法60只健康雄性SD大鼠... 详细信息

目的通过给SD大鼠灌肠三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇建立溃疡性结肠炎的大鼠模型,观察清热活血方对溃疡性结肠炎模型大鼠炎症损伤和β-arrestin 2相关蛋白表达的影响,探讨溃疡性结肠炎黏膜修复和防治的可能作用机制。方法60只健康雄性SD大鼠,分成正常组、模型组、美沙拉嗪组、中药低、中、高剂量组各10只。造模组以0.85ml TNBS/乙醇溶液造模,正常组以等量蒸馏水灌肠。造模1天后立即开始药物干预,中药低、中、高剂量组分别以2.1g/ml、4.2g/ml、8.4g/ml浓度的2ml中药灌肠,美沙拉嗪组以2ml 0.03g/ml的美沙拉嗪混悬液灌肠,正常组、模型组每天灌肠等容量的蒸馏水。给药10天后,解剖取大鼠结肠组织,用放大镜观察炎症及溃疡发生情况,并各取一小块结肠组织,以10%福尔马林溶液固定,石蜡包埋,切片,用于苏木素伊红(HE)染色,光镜下观察结肠组织病理学改变,用免疫组化法检测定β-arrestin2、NF-κB蛋白的表达。结果(1)正常组大鼠一般情况较好,大便性质、次数等未见明显改变。造模组大鼠精神萎靡,腹泻,甚者可出现粘液脓血便,消瘦明显。经美沙拉嗪及中药3种剂量灌肠给药后的4组大鼠,一般情况较模型组好转。(2)各组大鼠结肠组织大体形态评分:和正常组比较,其余各组评分明显升高,均具有非常显著的统计学差异(Pβ-arrestin2、NF-κB蛋白的表达:与正常组比较,其余各组β-arrestin2的表达都有不同程度下降,模型组、美沙拉嗪组具有统计学意义(Pβ-arrestin2的表达均有升高,其中美沙拉嗪组、中药低剂量组升高有统计学意义(Pβ-arrestin2表达升高具有显著性差异(P0.05)。与模型组相比,药物治疗组的NF-κB表达均明显下降,均具有非常显著性的差异(P2)俞氏清热活血法灌肠法能改善溃疡性结肠炎模型大鼠的腹泻、粘液脓血便的临床症状,减少结肠黏膜损伤及病理组织损伤,对治疗大鼠溃疡性结肠炎具有良好的功效。(3)俞氏清热活血法中药灌肠疗法可通过调控β-arrestin2表达进而抑制NF-κB表达,从而抑制炎症因子的释放,减少结肠黏膜损伤,促进黏膜修复。影响β-arrestin2相关蛋白表达是其防治溃疡性结肠炎的一大作用机理。

关键词：清热活血中药疗法溃疡性结肠炎 β-arrestin2 NF-κB

LiCl对七氟醚引起的神经细胞凋亡的缓解作用

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中国现代应用药学 2015年第5期32卷 524-529页

作者：王文元蔡放毛慧胡双飞浙江省人民医院杭州310014

目的研究氯化锂(LiCl)对中枢神经系统发育期七氟醚神经毒性的影响,以及β-arrestin2/AKT信号通路在其中所起的作用。方法对离体培养7 d的海马神经细胞及出生后7 d的Sprague-Dawley幼鼠进行七氟醚处理(3%,6 h),制备七氟醚神经毒性模型。... 详细信息

目的研究氯化锂(LiCl)对中枢神经系统发育期七氟醚神经毒性的影响,以及β-arrestin2/AKT信号通路在其中所起的作用。方法对离体培养7 d的海马神经细胞及出生后7 d的Sprague-Dawley幼鼠进行七氟醚处理(3%,6 h),制备七氟醚神经毒性模型。离体实验中给予Li Cl或Li Cl+β-arrestin2 si RNA转染处理后,应用流式细胞仪、MTT及Hoechst染色检测细胞凋亡;应用免疫印迹检测total AKT、Phospho-AKT、total GSK3β、Phospho-GSK3β、Bax及Bcl-2的蛋白表达水平;应用条件恐惧实验及Morris水迷宫检测实验动物的情绪及空间学习记忆功能变化。结果七氟醚处理(3%,6 h)使海马神经细胞凋亡增加,应用Li Cl则可明显缓解七氟醚神经毒性。七氟醚处理可降低Phospho-AKT及Bcl-2的蛋白表达,增加Phospho-GSK3β及Bax的蛋白表达;LiCl可增加Phospho-AKT及Bcl-2表达,降低Phospho-GSK3β及Bax表达水平。Li Cl的神经保护作用可被转染β-arrestin2 si RNA、SH-5或LY294002所逆转。Li Cl明显缓解了中枢神经系统发育期七氟醚处理引起的情绪及空间学习记忆功能异常。结论 Li Cl可缓解中枢神经系统七氟醚神经毒性,其机制可能与β-arrestin2依赖的AKT/GSK3β信号通路有关。

关键词：七氟醚氯化锂细胞凋亡 β-arrestin2 AKT/GSK3β 神经发育

致幻剂激活5-HT_(2A)R产生致幻作用的信号通路研究进展

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中国药理学通报 2022年第11期38卷 1607-1612页

作者：朱慧丽周培岚傅风华苏瑞斌烟台大学药学院山东烟台264005 军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京100850

经典血清素能致幻剂(又称致幻剂)是一种强大的精神活性物质可以强烈改变人的知觉、情绪和认知。目前普遍认为,致幻剂发挥致幻作用的主要靶点为5-HT_(2A)受体(5-hydroxytryptamine 2A Receptor,5-HT_(2A) R)。研究发现,5-HT_(2A) R作为G... 详细信息

经典血清素能致幻剂(又称致幻剂)是一种强大的精神活性物质可以强烈改变人的知觉、情绪和认知。目前普遍认为,致幻剂发挥致幻作用的主要靶点为5-HT_(2A)受体(5-hydroxytryptamine 2A Receptor,5-HT_(2A) R)。研究发现,5-HT_(2A) R作为G蛋白偶联受体,除了偶联经典的Gα_(q/11)-PLCβ信号通路外,还可偶联Gα_(i/o)、Gα_(12/13)和β-arrestin2等信号通路。但是,与致幻作用相关的受体后信号通路尚无定论。该文总结了近年来致幻剂激活5-HT_(2A) R后产生致幻作用的信号通路研究进展,为阐明幻觉产生的分子机制及发现新的药物靶点提供依据。

关键词：致幻剂 G蛋白偶联受体 5-HT_(2A)受体信号转导偏向性 G蛋白 β-arrestin2

β-arrestin 2 shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

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同济大学学报（医学版） 2017年第6期38卷 33-36,40页

作者：涂秋杰任涛同济大学附属东方医院呼吸内科上海200120

目的构建β-arrestin 2的shRNA慢病毒载体,获得稳定低表达β-arrestin 2的人非小细胞肺癌A549细胞并验证敲低效果。方法查询4对可信的β-arrestin 2敲低序列,将载体质粒pSicoR-GFP线性化,构建目的质粒,转化感受态细胞,对长出的克隆应用... 详细信息

目的构建β-arrestin 2的shRNA慢病毒载体,获得稳定低表达β-arrestin 2的人非小细胞肺癌A549细胞并验证敲低效果。方法查询4对可信的β-arrestin 2敲低序列,将载体质粒pSicoR-GFP线性化,构建目的质粒,转化感受态细胞,对长出的克隆应用菌落PCR鉴定,再对阳性结果进行测序和比对分析。重组病毒质粒与另外三种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,导入人非小细胞肺癌细胞A549中,用qRT-PCR检测转染效率。结果成功构建β-arrestin 2的shRNA慢病毒载体质粒,测序比对结果一致。qRT-PCR检测发现一组β-arrestin 2的mRNA表达只有对照组的56%。结论成功构建β-arrestin 2的shRNA慢病毒载体,并验证其在人非小细胞肺癌细胞A549中敲低效果显著。

关键词： β-arrestin2 shRNA 慢病毒非小细胞肺癌