GPR120通过抑制炎症反应和细胞凋亡保护缺血性脑损伤

作     者：任志萍 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘慧青

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：脑缺血 GPR120 炎症 细胞凋亡 β-arrestin2 

摘      要：[研究背景]缺血性脑卒中约占脑卒中的77%,因其高发病率,高致残率成为世界上第二大死亡原因,严重威胁中老年人的健康和生活。大脑中动脉栓塞(MCAO)是引发脑缺血最主要的原因,导致了 40%-80%的高死亡率。到目前为止,除了溶栓治疗以外,还没有发现更有效的治疗脑缺血的方法。已证实炎症反应以及细胞凋亡在脑卒中的病理进程发挥重要的作用。因此,探究具有抗炎以及抗凋亡作用的药物作用靶点对缺血性脑卒中的治疗具有重要的理论意义和实际应用价值。G蛋白偶联受体(GPCRs)是最大的膜蛋白受体家族,可以调节机体内多种生理学进程,并且是40%药物的作用靶标。然而,现今还有接近100种GPCRs被归类为“孤儿受体,其中包括GPR120。最近发现GPR120可以被长链不饱和脂肪酸激活,特别是ω-3游离脂肪酸,包含DHA和EPA。研究表明,ω-3游离脂肪酸激活GPR120,其可与β-arrestin2结合,发挥抗炎作用。另外,激活GPR120也可以通过调控PI3K/AKT或ERK信号通路发挥抗凋亡作用。但迄今为止,对于GPR120在缺血性脑血管疾病的作用以及机制尚无报道。[研究目的]本课题利用小鼠MCAO模型以及体外糖氧剥夺(OGD)模型探讨GPR120在缺血性脑损伤中的作用及机制。[研究方法]1.确定GPR120在脑缺血后的表达及其细胞定位。1.1 MCAO建立小鼠脑缺血模型,分别于缺血12 h,24 h,48 h,72 h取小鼠缺血侧大脑皮层缺血半暗带区域组织,利用Western b]ot和real-time PCR分别检测GPR120的蛋白及mRNA的表达水平;1.2免疫荧光双标方法检测GPR120在缺血侧大脑皮层中的表达以及细胞定位情况;1.3体外培养小胶质细胞系BV2细胞及神经细胞系PC12细胞,建立OGD模型,分别于OGD2 h,复氧2 h,6 h,12 h,24 h后,检测GPR120在两种细胞中蛋白及mRNA的表达水平。2.体外探究在小胶质细胞中GPR120对OGD诱导的炎症反应的调控。利用 GPR120 siRNA、β-arrestin2 shRNA 分别基因沉默 BV2 细胞的 GPR120、β-arrestin2,DHA激活GPR120,OGD损伤后,观察及检测:2.1 Western blot 和 real-time PCR 检测 3 组 GPR120-specific siRNA 的干扰效率;2.2 Western blot检测JNK和p38的磷酸化水平,COX2的蛋白水平变化;2.3 Real time PCR 检测炎症因子 IL-6,TNFα,IL-1β 的 mRNA 水平变化;2.4 ELISA法检测培养基中IL-1β的含量变化;2.5 Co-IP法检测GPR120与β-arrestin2的结合情况。3.体外探讨GPR120对OGD诱导的PC12细胞凋亡的调控作用及机制对正常及GPR120基因沉默PC12细胞建立OGD模型,观察及检测:3.1 Western blot检测GPR120 siRNA在PC12细胞中的干扰效率;3.2 Real-time PCR 检测炎症因子 IL-6,IL-1β 的 mRNA 水平;3.3 Flow cytometry检测细胞凋亡,CCK8法检测细胞存活率;3.4 Western blot检测AKT和ERK的磷酸化水平;3.5 利用 LY294002 或 U0126 分别抑制 PI3K/AKT 或 ERK 通路,Western blot 检测Bax,Bcl-2的蛋白水平。4.利用MCAO小鼠模型明确GPR120在缺血性脑损伤中的作用及机制。应用脑立体定位仪,向小鼠左侧大脑皮层双定点注射腺相关病毒(AAV)-shGPR120 或 AAV-Gfp,200mg/kg DHA 灌胃,每天一次,2 周后建立 MCAO模型,24 h后观察并检测:4.1 AAV定位注射3周后,real-time PCR检测AAV-shGPR120在大脑皮层中的基因沉默效率;4.2对小鼠进行神经功能学评分以及TTC染色计算其梗死面积;4.3 Western blot检测小鼠缺血侧皮层半暗带JNK和p38的磷酸化水平及COX2蛋白表达变化;4.4微量样本多指标流式蛋白定量技术(CBA)检测小鼠大脑皮层内炎症因子含量变化;4.5 Western blot检测小鼠缺血侧皮层半暗带Bax,Bcl-2蛋白水平。4.6 TUNEL染色检测凋亡细胞数目。[研究结果]1.在MCAO模型中,在小鼠的大脑皮层半暗带GPR120的蛋白及mRNA的水平明显升高。通过免疫荧光双标发现,在正常组织GPR120主要分布在小胶质细胞中,星形胶质细胞、神经元中含量较低,但是脑缺血后可以明显上调小胶质细胞和神经元中GPR120的表达。此外,体外实验也证实小