MDM2-β-arrestin 2在缺血-再灌注诱发肾内皮细胞AT1R表达异常中的作用机制

作     者：徐子昱 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：苏华

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：缺血-再灌注损伤 内皮细胞 胞吞 MDM2 β-arrestin2 AT1R 

摘      要：目的:供肾获取、保存与分配中的(热/冷)缺血与血管吻合后血供的再恢复常导致移植肾缺血-再灌注(Ischemia-Reperfusion,I/R)损伤。I/R所致微血管内皮细胞损伤是启动抗体介导排斥反应(Antibody Mediated Rejection,ABMR)的关键事件,血管紧张素Ⅱ1型受体(Angiotensin II type 1 Receptor,AT1R)介导的ABMR是影响移植肾预后的待解难题。既往研究证明,E3泛素连接酶MDM2在I/R状态下加速内皮细胞表面AT1R的胞吞,而直接调控AT1R胞吞的β-arrestin 2受MDM2的正向调控。本研究旨在探讨MDM2-β-arrestin 2对AT1R的调控作用与机制,为防控I/R诱导的ABMR提供针对性的策略。方法:(1)C57BL/6小鼠夹闭双侧肾动脉30分钟,再灌注3天,建立缺血-再灌注动物模型。(2)C57BL/6小鼠双侧肾脏皮质多点注射AAV9型腺相关病毒(每侧4×10)诱导MDM2过表达,或注射等量空载病毒,4周后建立缺血-再灌注动物模型。(3)体外培养的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)和人肾小球内皮细胞(Human Renal Glomerular Endothelial Cells,HRGECs)氧糖剥夺(Oxygen Glucose Deprivation,OGD)1小时,复氧12小时,建立缺氧-复氧(Hypoxia–Reoxygenation,H/R)细胞模型。(4)在体外培养的内皮细胞中使用Neofect转染MDM2过表达质粒诱导MDM2过表达,48小时后建立缺氧-复氧细胞模型。(5)转染MDM2过表达质粒的内皮细胞与β-arrestin 2抑制剂Bosentan(20μM)或胞吞抑制剂Barbadin(100μM)共孵育,30分钟后建立缺氧-复氧细胞模型。(6)收集小鼠血标本检测生化指标尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)和肌酐(Serum Creatinine,SCr)水平。(7)小鼠肾组织石蜡切片进行苏木素-伊红染色(Hematoxylin-Eosin Staining,HE)观察其肾脏病理变化。(8)免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)和免疫荧光法(Immunofluorescence,IF)检测小鼠肾组织MDM2、β-arrestin 2、AT1R以及内皮细胞功能标志表达变化。(9)免疫荧光法检测体外培养的内皮细胞MDM2、β-arrestin 2以及胞膜AT1R的表达变化。(10)使用Thermo Scientific公司货号89842的胞膜提取试剂盒按照说明书流程提取内皮细胞胞膜蛋白用于后续Western blot检测。(11)提取小鼠肾组织蛋白和内皮细胞蛋白,采用免疫印迹法(Western Blot,WB)检测细胞内MDM2、β-arrestin 2、AT1R及内皮细胞功能标志物表达变化。结果:(1)I/R小鼠血清尿素氮和肌酐水平的升高伴有明显的小鼠肾脏病理学损害及内皮细胞功能障碍。(2)I/R小鼠肾组织MDM2、β-arrestin 2表达下降,伴随AT1R的表达升高。(3)缺氧-复氧的内皮细胞中,MDM2、β-arrestin 2表达下调,伴随细胞总体及胞膜AT1R的表达增加。(4)使用AAV9型腺相关病毒上调MDM2表达的I/R小鼠,其血清尿素氮和肌酐水平升高、肾脏病理学损害及内皮功能障碍得到改善;下调的β-arrestin 2表达被逆转;AT1R表达升高得到抑制。(5)转染MDM2过表达质粒的内皮细胞中,缺氧-复氧引起的β-arrestin 2表达下降被逆转,AT1R在胞膜的表达升高被抑制。(6)转染MDM2过表达质粒的内皮细胞与β-arrestin 2抑制剂Bosentan共孵育30分钟后建立缺氧-复氧模型,MDM2下调胞膜AT1R表达的作用被抑制。(7)转染MDM2过表达质粒的内皮细胞与抑制β-arrestin2-AP2介导的内吞作用的药物Barbadin共孵育30分钟后建立缺氧-复氧模型,MDM2下调胞膜AT1R表达的作用被抑制。结论:缺血-再灌注引起肾脏内皮细胞总体及胞膜AT1R表达上调,导致内皮细胞功能障碍,其作用机制可能是通过MDM2-β-arrestin 2调节clathrin-AP2依赖的AT1R的内吞。