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Versatile plant genome engineering using anti-CRISPR-Cas12a systems

Science China Life Sciences 2024年

作者： Yao He Shishi Liu Long Chen Dongkai Pu Zhaohui Zhong Tang Xu qiurong ren Chuan Dong Yawei Wang Danning Wang Xuelian Zheng Fengbiao Guo Tao Zhang Yiping Qi Yong Zhang Integrative Science Center of Germplasm Creation in Western China (Chongqing) Science City Chongqing Key Laboratory of Tree Germplasm Innovation and Utilization School of Life Sciences Southwest University Department of Biotechnology School of Life Sciences and Technology Center for Informational Biology University of Electronic Science and Technology of China Sichuan Institute of Edible Fungi Sichuan Academy of Agricultural Sciences Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular Breeding/Zhongshan Biological Breeding Laboratory/Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education College of AgricultureYangzhou University Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops/Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology Yangzhou University Department of Respiratory and Critical Care Medicine Zhongnan Hospital of Wuhan University Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery Ministry of Education and School of Pharmaceutical Sciences Wuhan University Department of Plant Science and Landscape Architecture University of Maryland College Park 20742 Institute for Bioscience and Biotechnology Research University of Maryland

CRISPR-Cas12a genome engineering systems have been widely used in plant research and crop breeding. To date, the performance and use of anti-CRISPR-Cas12a systems have not been fully established in plants. Here, we conduct in silico analysis to identify putative anti-CRISPR systems for Cas12a. These putative anti-CRISPR proteins, along with known anti-CRISPR proteins, are assessed for their ability to inhibit Cas12a cleavage activity in vivo and in planta. Among all anti-CRISPR proteins tested, AcrVA1 shows robust inhibition of Mb2Cas12a and LbCas12a in E. coli. Further tests show that AcrVA1 inhibits LbCas12a mediated genome editing in rice protoplasts and stable transgenic lines. Impressively, co-expression of AcrVA1 mitigates off-target effects by CRISPR-LbCas12a, as revealed by whole genome sequencing. In addition, transgenic plants expressing AcrVA1 exhibit different levels of inhibition to LbCas12a mediated genome editing, representing a novel way of fine-tuning genome editing efficiency. By controlling temporal and spatial expression of AcrVA1, we show that inducible and tissue specific genome editing can be achieved in plants. Furthermore, we demonstrate that AcrVA1 also inhibits LbCas12a-based CRISPR activation(CRISPRa) and based on this principle we build logic gates to turn on and off target genes in plant cells. Together, we have established an efficient anti-CRISPR-Cas12a system in plants and demonstrate its versatile applications in mitigating off-target effects, finetuning genome editing efficiency, achieving spatial-temporal control of genome editing, and generating synthetic logic gates for controlling target gene expression in plant cells.

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现代农业背景下豆种产业高质量发展研究

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中国农机装备 2024年第1期 107-109页

作者：任秋荣山东省嘉祥县梁宝寺镇人民政府嘉祥272400

围绕现代农业发展的新要求和鲁西南地区豆种产业的实际情况,分析了豆种产业的发展现状和当前产业发展面临的主要问题,如经济效益偏低、种业企业竞争力不强、企业发展用地和融资难等,提出了一系列促进鲁西南地区豆种产业高质量发展的策略... 详细信息

围绕现代农业发展的新要求和鲁西南地区豆种产业的实际情况,分析了豆种产业的发展现状和当前产业发展面临的主要问题,如经济效益偏低、种业企业竞争力不强、企业发展用地和融资难等,提出了一系列促进鲁西南地区豆种产业高质量发展的策略,以指导鲁西南地区豆种产业在现代农业背景下实现转型升级和高质量发展。

关键词：鲁西南地区豆种产业高质量发展

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Plant Prime Editors Enable Precise Gene Editing in Rice Cells

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Molecular Plant 2020年第5期13卷 667-670页

作者： Xu Tang Simon Sretenovic qiurong ren Xinyu Jia Mengke Li Tingting Fan Desuo Yin Shuyue Xiang Yachong Guo Li Liu Xuelian Zheng Yiping Qi Yong Zhang Department of Biotechnology School of Life Sciences and TechnologyCenter for Informational BiologyUniversity of Electronic Science and Technology of ChinaRoom 216Main BuildingNo.4Section 2North Jianshe RoadChengdu 610054China Department of Plant Science and Landscape Architecture University of MarylandCollege ParkMD 20742USA Hubei Academy of Agricultural Sciences Wuhan 430064China lnstitute for Bioscience and Biotechnology Research University of MarylandRockvilleMD 20850USA

Genome editing is revolutionizing plant research and crop ***-specific nucleases(SSNs)such as zinc finger nuclease(ZFN)and TAL effector nuclease(TALEN)have been used to create site-specific DNA double-strand breaks and to achieve precise DNA modifications by promoting homology-directed repair(HDR)(Steinert et al.,2016;Voytas,2013).Later,RNA-guided SSNs such as CRISPR-Cas9,Cas12a,Cas12b,and their variants were applied for genome editing in plants(Li et al.,2013;Nekrasov et alM 2013;Tang et al.,2017;Zhong et al.,2019;Ming et al.,2020;Tang et al.,2019).However,HDR relies on simultaneous delivery of SSNs and DNA donors,which has been challenging in plants(Steinert et al.,2016;Zhang et aL,2019).Another challenge for realizing efficient HDR in plants is that DNA repair favors nonhomologous end joining(NHEJ)pathways over HDR in most cell types(Puchta,2005;Qi et al.,2013).

关键词： precise Prime Plant

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Plant Genome Editing Using FnCpfl and LbCpf Nucleases at Redefined and Altered PAM-Sites

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Molecular Plant 2018年第7期11卷 999-1002页

作者： ZhaohuiZhong Yingxiao Zhang Qi You XU Tang qiurong ren Shishi Liu Lijia Yang Yan Wang Xiaopei Liu Binglin Liu Tao Zhang Xuelian Zheng Ysa Le Yong Zhang Yiping Qi Department of Biotechnology School of Life Sciences and Technology Center for Informational Biology University of Electronic Science andTechnology of China Room 216 Main Building No. 4 Section 2 North J~anshe Road Chengdu 610054 P.R. China Department of Plant Science and Landscape Architecture University of Maryland College Park MD 20742 USA Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology Co-InnovationCenter for Modern Production Technology of Grain Crops Key Laboratory ofPlant Functional Genomics of the Ministry of Education Yangzhou University Yangzhou 225009 China Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety of Ministry of Education of China Yangzhou University Yangzhou 225009 China Institute for Bioscience and Biotechnology Research University of Maryland Rockville MD 20850 USA These authors contributed equally to this article.

Dear Editor CRISPR from Prevotella and Francisella 1 （Cpfl） is an emerging RNA-guided endonuclease system that relies on thymidine-rich protospacer adjacent motif （PAM） for DNA targeting （Zetsche et al., 2015）. CRISPR-Cpfl has unique features that could be advantageous over the CRISPR-Cas9 system. For example, Cpfl requires only a 42 nt crRNA, while Cas9 uses 100 nt gRNA. While Cas9 generates blunt ends of DNA breaks, the Cpfl cleavage results in 5＇ overhangs distal from the protospacer, which may improve efficiency for NHEJ-based gene insertion. Interestingly, Cpfl proteins also have RNase activity （Fonfara et al., 2016）, which was utilized to process crRNA arrays for multiplexed genome editing in both mammalian systems and plants （Wang et al., 2017; Zetsche et al., 2017）.

关键词： TARGETED MUTAGENESIS CPF1 RICE

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Improving Plant Genome Editing with High-Fidelity xCas9 and Non-canonical PAM-Targeting Cas9-NG

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Molecular Plant 2019年第7期12卷 1027-1036页

作者： Zhaohui Zhong Simon Sretenovic qiurong ren Lijia Yang Yu Bao Caiyan Qi Mingzhu Yuan Yao He Shishi Liu Xiaopei Liu Jiaheng Wang Lan Huang Yan Wang Dibin Baby David Wang Tao Zhang Yiping Qi Yong Zhang Department of Biotechnology School of Life Sciences and Technology Center for Informational Biology University of 曰ectronic Science and Technology of China Room 216 Main Building No. 4 Section 2 North Jianshe Road Chengdu 610054 China Department of Plant Science and Landscape Architecture University of Maryland College Park MD 20742 USA Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education Yangzhou University Yangzhou 225009 China Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety of Ministry of Education of China Yangzhou University Yangzhou 225009 China Indian Institute of Science Education and Research Timpati Andhra Pradesh 517507 India Seven Lakes High School Katy TX 77494 USA Institute for Bioscience and Biotechnology Research University of Maryland Rockville MD 20850 USA

Two recently engineered SpCas9 variants, namely xCas9 and Cas9-NG, show promising potential in improving targeting specificity and broadening the targeting range. In this study, we evaluated these Cas9 variants in the model and crop plant, rice. We first tested xCas9-3.7, the most effective xCas9 variant in mammalian cells, for targeted mutagenesis at 16 possible NGN PAM (protospacer adjacent motif) combinations in duplicates. xCas9 exhibited nearly equivalent editing efficiency to wild-type Cas9 (Cas9-WT) at most canonical NGG PAM sites tested, whereas it showed limited activity at non-canonical NGH (H = A, C, T) PAM sites. High editing efficiency of xCas9 at NGG PAMs was further demonstrated with C to T base editing by both rAPOBECI and PmCDAI cytidine deaminases. With mismatched sgRNAs, we found that xCas9 had improved targeting specificity over the Cas9-WT. Furthermore, we tested two Cas9-NG variants, Cas9-NGv1 and Cas9-NG, for targeting NGN PAMs. Both Cas9-NG variants showed higher editing efficiency at most non-canonical NG PAM sites tested, and enabled much more efficient editing than xCas9 at AT-rich PAM sites such as GAT, GAA, and CAA. Nevertheless, we found that Cas9-NG variants showed significant reduced activity at the canonical NGG PAM sites. In stable transgenic rice lines, we demonstrated that Cas9-NG had much higher editing efficiency than Cas9-NGv1 and xCas9 at NG PAM sites. To expand the base-editing scope, we developed an efficient C to T base-editing system by making fusion of Cas9-NG nickase (D10A version), PmCDAI, and UGI. Taken together, our work benchmarked xCas9 as a high-fidelity nuclease for targeting canonical NGG PAMs and Cas9-NG as a preferred variant for targeting relaxed PAMs for plant genome editing.

关键词： xCas9 Cas9-NG high fidelity non-canonical PAM base editing

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一种低低温省煤器泄漏检测技术

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电子测试 2021年第6期32卷 99-100页

作者：任秋荣福建龙净环保股份有限公司福建龙岩364000

随着我国社会的持续发展,节能环保理念已深入人心,国家对于燃煤电厂污染物的排放提出了严格的要求标准,低低温省煤器因其节能效果显著,且对于电除尘收尘效率的提高有明显的辅助作用,现广泛应用于燃煤电厂中,但因其所处的烟气环境恶劣,... 详细信息

随着我国社会的持续发展,节能环保理念已深入人心,国家对于燃煤电厂污染物的排放提出了严格的要求标准,低低温省煤器因其节能效果显著,且对于电除尘收尘效率的提高有明显的辅助作用,现广泛应用于燃煤电厂中,但因其所处的烟气环境恶劣,运行后大量的低低温省煤器存在泄漏的问题,这就需要对于泄漏进行在线监测。本文提出了一种低低温省煤器泄漏检测的防法,并在工程应用中已使用。

关键词：低低温省煤器泄露检测

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土荆芥醇提物对MCF-7细胞增殖的影响

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四川师范大学学报（自然科学版） 2017年第4期40卷 531-535页

作者：朱晓换张杜宇钟守慧任秋蓉王亚男四川师范大学细胞生物学研究室四川成都610101 四川大学生命科学学院四川成都610064

为研究土荆芥醇提物对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用及其相关机制,采用MTT法检测细胞增殖抑制率,Hochest染色观察细胞核的形态变化,分光光度计法检测抗氧化酶相对活性和丙二醛相对含量.结果表明:土荆芥醇提物对MCF-7细胞增殖具有显... 详细信息

为研究土荆芥醇提物对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用及其相关机制,采用MTT法检测细胞增殖抑制率,Hochest染色观察细胞核的形态变化,分光光度计法检测抗氧化酶相对活性和丙二醛相对含量.结果表明:土荆芥醇提物对MCF-7细胞增殖具有显著的抑制作用,且具有时间和浓度效应(P<0.01),作用12、24、48 h后,其IC_(50)值分别是3.85、3.70和3.28 mg/m L;形态学观察显示,细胞核出现凋亡小体、染色质凝集、呈边缘化分布等典型的凋亡特征;随土荆芥醇提物浓度增大,超氧化物歧化酶和过氧化氢酶相对活性先升高后降低,丙二醛相对含量先升高,而后保持恒定,在质量浓度3.50 mg/m L时三者均达到最高值.结论:土荆芥醇取物抑制MCF-7细胞增殖是通过扰乱细胞抗氧化系统,诱导细胞氧化损伤,最终导致细胞凋亡.

关键词：土荆芥醇提物 MCF-7细胞细胞凋亡氧化损伤

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四川产土荆芥总黄酮成分鉴别及其抗氧化和抑菌活性研究

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食品工业 2018年第11期39卷 167-171页

作者：钱瑞华任秋蓉黄婧周玉俊张佳佳王亚男四川师范大学生命科学学院成都610101

探讨四川产土荆芥植株总黄酮化学组分及其体外抗氧化和抗菌活性。通过显色反应鉴定四川产土荆芥植株总黄酮成分类别,水杨酸法、DPPH法和邻苯三酚法评价其体外抗氧化活性,打孔法评价其体外抑菌活性。结果表明,四川产土荆芥总黄酮含量为53... 详细信息

探讨四川产土荆芥植株总黄酮化学组分及其体外抗氧化和抗菌活性。通过显色反应鉴定四川产土荆芥植株总黄酮成分类别,水杨酸法、DPPH法和邻苯三酚法评价其体外抗氧化活性,打孔法评价其体外抑菌活性。结果表明,四川产土荆芥总黄酮含量为53.41 mg/g,主要为黄酮醇类、二氢黄酮类及二氢黄酮醇类。总黄酮对羟自由基(·OH)、DPPH自由基(DPPH·)和超氧阴离子自由基(O_2^-·)均具有清除能力,其中对·OH和O_2^-·的清除能力较强。总黄酮对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)等均具有较强的抑制作用。四川产土荆芥植株总黄酮具有较好的体外抗氧化性能和抑菌活性,可作为一种潜在的天然抗氧化剂和抑菌剂进行开发利用。

关键词：四川土荆芥总黄酮成分鉴别抗氧化抑菌

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微量植物组织直接RT-PCR反应检测4种植物病毒的方法建立与优化

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四川师范大学学报（自然科学版） 2021年第1期44卷 111-117页

作者：李姣任秋蓉古蕾朱晓换王亚男四川师范大学生命科学学院四川成都610101

建立并优化微量植物组织直接RT-PCR反应检测病毒的方法:在立体显微镜下,用26 G无菌注射器针头刺入植物茎、叶柄或根中,将沾有组织液的针头直接浸入RT反应液中,通过PCR反应产生病毒特异性DNA条带.该方法在葡萄、苹果、马铃薯和百合中有... 详细信息

建立并优化微量植物组织直接RT-PCR反应检测病毒的方法:在立体显微镜下,用26 G无菌注射器针头刺入植物茎、叶柄或根中,将沾有组织液的针头直接浸入RT反应液中,通过PCR反应产生病毒特异性DNA条带.该方法在葡萄、苹果、马铃薯和百合中有效检测了葡萄卷叶相关病毒3(GLRav-3)、苹果茎沟病毒(ASGV)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)和黄瓜花叶病毒(CMV);消除了传统RT-PCR制备RNA模板复杂耗时的缺点.

关键词：微量植物组织直接RT-PCR反应葡萄卷叶相关病毒3(GLRav-3) 苹果茎沟病毒(AS-GV) 马铃薯卷叶病毒(PLRV) 黄瓜花叶病毒(CMV)

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Ca+GA_(3)处理对减轻芦柑裂果的生理与分子机制研究

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果树学报 2024年第8期41卷 1563-1576页

作者：吴维林周秋蓉黄嘉康任华晴陈伊冉张加成杜茜张宇平王平福建农林大学园艺学院·作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室福州350002 福建省永春县天马柑橘场福建永春362600

【目的】探究减轻芦柑裂果的生理与分子机制。【方法】以10年生早熟芦柑(易裂品种)为试材,果面喷施0.3 g·L^(-1)螯合钙和10 mg·L^(-1)GA_(3)为处理,以清水为对照(CK)。测定裂果率和果实外观品质,同时测定果皮ROS含量和抗氧化能力、细... 详细信息

【目的】探究减轻芦柑裂果的生理与分子机制。【方法】以10年生早熟芦柑(易裂品种)为试材,果面喷施0.3 g·L^(-1)螯合钙和10 mg·L^(-1)GA_(3)为处理,以清水为对照(CK)。测定裂果率和果实外观品质,同时测定果皮ROS含量和抗氧化能力、细胞壁代谢酶活性和结构成分含量,以及抗氧化酶和细胞壁代谢酶相关基因表达差异。【结果】Ca+GA_(3)处理有效降低了裂果率,增大了芦柑果形指数、单果质量和果顶果皮厚度;提高了芦柑果皮中抗氧化酶SOD、CAT活性,降低了H_(2)O_(2)、O_(2)^(·-)产生速率和MDA含量以及POD、PPO活性。同时,Ca+GA_(3)处理提高了芦柑果皮果胶、纤维素含量,降低木质素含量以及PME、PL、PG、CX和PAL、4CL、C4H活性;提高了果皮的延展性和韧性,减少了裂果的发生。Ca+GA_(3)处理显著提高了抗氧化酶相关基因CrSOD、CrCAT在芦柑果皮中的相对表达量,降低了CrPOD、CrPPO以及细胞壁代谢相关基因CrPME、CrPL、CrPG、CrCX、CrPAL、Cr4CL、CrC4H的相对表达量。【结论】在生理与分子水平上明确了Ca+GA_(3)处理可以通过调控果皮活性氧代谢与细胞壁代谢来降低裂果率。研究结果对生产上预防和减轻芦柑裂果具有一定理论意义和应用价值。

关键词：芦柑裂果 Ca+GA_(3)处理活性氧代谢细胞壁代谢

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