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马铃薯Y病毒福建分离物P1基因的分子变异和结构特征

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遗传 2014年第7期36卷 713-722页

作者：史凤阳高芳銮沈建国常飞詹家绥福建农林大学植物病毒研究所福建省植物病毒学重点实验室福州350002 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心福州350001

为揭示马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)P1基因的分子变异及结构特征,并查明福建分离物P1基因的变异来源。文章设计一对简并引物从感染PVY的马铃薯病叶扩增、克隆获得福建分离物P1基因的cDNA全长序列,分析其核苷酸序列和氨基酸序列的特... 详细信息

为揭示马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)P1基因的分子变异及结构特征,并查明福建分离物P1基因的变异来源。文章设计一对简并引物从感染PVY的马铃薯病叶扩增、克隆获得福建分离物P1基因的cDNA全长序列,分析其核苷酸序列和氨基酸序列的特征,并采用贝叶斯法重建P1基因的系统发育树。结果显示,12个福建分离物均成功扩增出预期大小(约915 bp)的特异性片段,P1基因的核苷酸序列与已报道的PVY不同株系的核苷酸序列一致性为73%～99%;QK44、XT02、XT08、LH05分离物的309 nt位置均检测到一个强烈的重组信号。12个PVY分离物中,P1蛋白有85个变异的氨基酸位点,表明其高度变异;P1蛋白的第41～275位是一个高度保守的结构功能域,含有3个保守的活性位点(H192、D201、V235);系统发育分析显示,福建分离物形聚为3种不同的簇,其对应的卷曲结构(Coiled-coil domain)和空间结构也不相同,表明不同株系型的P1基因在系统发育关系上分化较大。该研究结果表明PVY P1基因在核苷酸序列、氨基酸序列以及空间结构具有高度变异性,但行使P1蛋白功能的活性位点所在的氨基酸(H192、D201和V235)均高度保守;福建分离物P1基因的变异源主要来自碱基突变和基因重组。

关键词：马铃薯Y病毒 P1基因变异重组

抗TMV的植物筛选及提取条件对抗病毒物质活性的影响

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2004年第7期32卷 45-49页

作者：翟梅枝高芳銮沈建国林奇英谢联辉福建农林大学植物病毒所

　对26种植物样品进行了抗病毒(TMV)活性测定。结果表明,不同植物提取物对TMV侵染心叶烟的抑制效果不同,其中莲、榕树、柿子、杨梅、水蜈蚣、叶下珠、羊蹄甲和菊花对TMV的抑制率在90%以上;对高活性抗病毒植物莲叶而言,抗病毒物质的活性... 详细信息

　对26种植物样品进行了抗病毒(TMV)活性测定。结果表明,不同植物提取物对TMV侵染心叶烟的抑制效果不同,其中莲、榕树、柿子、杨梅、水蜈蚣、叶下珠、羊蹄甲和菊花对TMV的抑制率在90%以上;对高活性抗病毒植物莲叶而言,抗病毒物质的活性因提取溶剂和提取方法的不同而异,水作为溶剂提取时,提取物对TMV的抑制率仅约为70%,而以甲醇和体积分数95%的乙醇作溶剂提取时,提取物对TMV的抑制率约在98%以上;用体积分数95%的乙醇为溶剂,采用索氏提取、回流提取和冷浸提取时,所得提取物对TMV的抑制率均为100%。冷浸提取的优化条件是:以体积分数95%的乙醇为提取溶剂,料液比20∶180(1∶9)提取12h。

关键词：植物源病毒抑制剂烟草花叶病毒植物活性筛选提取方法

不同寄主来源的马铃薯Y病毒群体遗传结构的比较分析

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遗传 2015年第3期37卷 292-301页

作者：常飞邹文超高芳銮沈建国詹家绥福建省植物病毒学重点实验室福建农林大学植物病毒研究所福州350002 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心福州350001

文章以马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）P3和pipo基因为分子标记,比较分析烟草和马铃薯两个寄主的PVY遗传多样性和群体分化,并评估突变、选择、基因流等遗传力所起的作用。通过P3和pipo基因计算获得的烟草和马铃薯群体分化指数FST分别... 详细信息

文章以马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）P3和pipo基因为分子标记,比较分析烟草和马铃薯两个寄主的PVY遗传多样性和群体分化,并评估突变、选择、基因流等遗传力所起的作用。通过P3和pipo基因计算获得的烟草和马铃薯群体分化指数FST分别为0.116和0.120,且统计检验差异显著,表明烟草和马铃薯寄主的PVY之间中度分化。变异分析结果显示,烟草分离物P3和pipo基因的核苷酸序列一致性分别为85.2%~100%和76.5%~100%,而马铃薯分离物的P3和pipo基因的核苷酸序列一致性分别为95.7%~100%和93.0%~100%,表明烟草PVY变异程度高于马铃薯。同时,P3基因内检测到大量的净化选择位点,表明该基因大部分位点的变异为有害突变,在进化过程中被剔除。此外,P3基因内还检测到两个显著正向选择位点,表明这两个位点的变异为有益突变,有利于病毒的生存竞争。在pipo基因中未检测到显著的选择位点,表明该基因上的变异基本不受自然选择影响。通过P3和pipo基因计算烟草和马铃薯群体间的基因流Nm值分别为1.91和1.83,表明这两个群体间存在较强的基因交流。以上结果表明,来源于烟草和马铃薯寄主的PVY遗传差异显著,突变、自然选择以及基因流都影响两者的遗传多样性及遗传分化程度。

关键词：马铃薯Y病毒 P3基因 pipo基因遗传变异

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辣椒脉斑驳病毒的多基因联合检测与鉴定

中国农业科学 2020年第16期53卷 3412-3420页

作者：杨宏凯杨晶文沈建国蔡伟高芳銮福建农林大学植物病毒研究所福建省植物病毒学重点实验室福州海关技术中心榕城海关综合技术服务中心

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是辣椒生产上危害严重的病毒,也是口岸检疫的重要病毒之一。本文旨在建立一种快速检测ChiVMV的多基因联合检测方法,实现ChiVMV的快速、准确鉴定。【方法】利用DAS-ELISA、RT-... 详细信息

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是辣椒生产上危害严重的病毒,也是口岸检疫的重要病毒之一。本文旨在建立一种快速检测ChiVMV的多基因联合检测方法,实现ChiVMV的快速、准确鉴定。【方法】利用DAS-ELISA、RT-PCR方法对印度进境辣椒进行检测以确定是否携带有ChiVMV。根据ChiVMV外壳蛋白(coat protein,CP)和圆柱状内含体蛋白(cytoplasmic inclusion protein,CI)保守区域分别设计引物,筛选两个基因(CP和CI)的特异性引物组合,通过设定不同的引物用量组合以及对退火温度等条件进行优化,探索最佳的反应条件,建立多基因联合检测方法。利用建立的多基因联合检测体系对包含ChiVMV在内的辣椒病毒进行检测,以验证该体系特异性。同时对ChiVMV阳性样品的不同浓度cDNA进行扩增,测定其检测灵敏度。此外,对田间辣椒样本进行检测,以验证体系的实际应用效果。【结果】通过对印度进境辣椒的DAS-ELISA检测,发现样品提取液与ChiVMV呈阳性反应;利用CP861-F/CP861-R特异性引物对进行RT-PCR,扩增出与预期大小相一致的特异性片段,确认该批辣椒样品携带有ChiVMV。多基因联合检测体系中,应用引物对CP337-F/CP337-R、CI655-F/CI655-R分别扩增出长度为337、655 bp的特异性目的片段。经优化后的反应体系和程序为cDNA 2μL、CP337-F/CP337-R各0.625μL(10μmol·L)、CI655-F/CI655-R各1.375μL(10μmol·L)、2×PCR Master Mix12.5μL、ddH2O 6.5μL,退火温度50℃,共35个循环。建立的多基因联合检测方法具有良好的特异性和灵敏度,两个基因检测灵敏度均为10-4数量级。实际应用检测结果表明,该方法可从感染ChiVMV的样品中同时扩增出CP和CI的特异性目的片段。【结论】建立的多基因联合检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,可为辣椒脉斑驳病毒的快速检测提供可靠的技术支持。

关键词：辣椒脉斑驳病毒外壳蛋白基因圆柱状内含体蛋白基因多基因联合检测

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建兰花叶病毒的遗传变异及其寄主适应性

园艺学报 2024年第1期51卷 203-212页

作者：关夏玉陈细红郭菁吕浩阳梁晨媛高芳銮福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室福州350002 福建农林大学园艺学院福州350002 福建省检验检疫技术研究重点实验室福州海关技术中心福州350001

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)是危害兰花并造成重要经济损失的病毒之一。为揭示CymMV的遗传变异及其适应性进化特征,新测定了16个CymMV石斛兰(Dendrobium nobile)分离物的外壳蛋白基因(coat protein,CP)序列,并结合已报... 详细信息

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)是危害兰花并造成重要经济损失的病毒之一。为揭示CymMV的遗传变异及其适应性进化特征,新测定了16个CymMV石斛兰(Dendrobium nobile)分离物的外壳蛋白基因(coat protein,CP)序列,并结合已报道的52个CymMV中国分离物CP基因序列进行遗传变异及进化分析。遗传多样性分析结果显示,68个CymMV分离物CP基因的核苷酸多样性(Pi)和单倍型多样性(Hd)平均值分别为0.039和0.992,表明该病毒具有较高的遗传多样性。分子变异分析(analysis of molecular variance,AMOVA)显示,CymMV变异源主要来自于病毒个体,约占总变异的71.72%。群体遗传结构分析显示,该病毒可以分为两个大簇(Cluster),CymMV建兰(Cymbidium ensifolium)分离物独立为一簇(Cluster 1),其他寄主分离物聚为另一大簇(Cluster 2),Cluster2内相同寄主来源的病毒分离物倾向于相聚成簇。进一步的系统发育与性状关联分析结果显示CymMV与寄主来源存在显著的关联性。上述结果表明,CymMV的遗传变异具有寄主特异性,其适应性进化主要受寄主因素所驱动。

关键词：建兰花叶病毒外壳蛋白基因遗传多样性主成分判别分析适应性进化

中国马铃薯Y病毒的检测鉴定及CP基因的分子变异

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中国农业科学 2013年第15期46卷 3125-3133页

作者：高芳銮沈建国史凤阳方治国谢联辉詹家绥福建省植物病毒学重点实验室福建农林大学植物病毒研究所福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心

【目的】查明马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)病在中国的发生情况,及时、准确地鉴定出PVY并对其分子变异进行分析。【方法】采用ELISA方法对采自中国14个省(直辖市)马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行了检测,并对其中的部分材料镜检... 详细信息

【目的】查明马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)病在中国的发生情况,及时、准确地鉴定出PVY并对其分子变异进行分析。【方法】采用ELISA方法对采自中国14个省(直辖市)马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行了检测,并对其中的部分材料镜检验证,然后根据CP基因序列设计1对简并引物针对随机选择感染PVY的14个省(直辖市)代表样品进行CP基因扩增克隆,将测序得到的序列进行分子变异分析,并使用贝叶斯法(Bayesian inference,BI)重建系统发育关系。【结果】ELISA检测结果表明,691份样品中220个样品与PVY抗体呈阳性反应,其余呈阴性反应;ELISA检测的阳性材料在透射电镜下均可观察到明显的风轮状内含体,14个PVY分离物均成功扩增出预期大小(约800 bp)的特异性片段,CP基因的核苷酸序列与已报道PVY不同株系的核苷酸序列一致性均在88%以上;在14个PVY分离物CP基因中共发现有29个多态性位点,其中6个简约信息位点,23个单一变异位点。系统发育分析结果显示,14个PVY分离物与PVYN:O株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上,与PVYN:O株系的亲缘关系最近。【结论】PVY CP基因高度保守,但不同地区分离物也存在一定的分子变异,本研究可为今后了解PVY病毒病流行、变异趋势及其防治提供依据。

关键词：马铃薯Y病毒 ELISA 外壳蛋白基因分子变异贝叶斯法

采用多基因联合方法鉴定福建长乐和福清产区马铃薯Y病毒株系组成

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中国农业科学 2016年第20期49卷 3918-3926页

作者：沈林林邹文超高芳銮詹家绥福建农林大学植物病毒研究所/福建省植物病毒学重点实验室

【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯生产上危害较为严重的病毒,也是制约马铃薯可持续发展的主要病毒之一。论文旨在开发一套简便、准确、快速的PVY分子鉴定技术,并采用该技术及时查明福建省部分产区PVY病害的发生、分布及... 详细信息

【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯生产上危害较为严重的病毒,也是制约马铃薯可持续发展的主要病毒之一。论文旨在开发一套简便、准确、快速的PVY分子鉴定技术,并采用该技术及时查明福建省部分产区PVY病害的发生、分布及PVY株系组成。【方法】采用ELISA方法对采自福建省长乐市、福清市马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行检测,并根据文献报道的PVY P1、VPg和CP基因保守区设计3对简并引物,对ELISA检测后的阳性样品进行基因扩增、克隆,并将获得的序列进行核苷酸序列一致性、重组位点、基因型分布和系统发育分析。【结果】ELISA检测结果表明,17份样品中有13个样品与PVY抗体呈阳性反应,其他呈阴性反应。13个阳性样品均能成功扩增出3个与P1、VPg和CP基因预期大小一致的特异片段。BLAST比对分析显示P1、VPg和CP基因与文献报道的已知PVY分离物的核苷酸序列一致性分别为72%—99%、85%—99%和88%—99%。P1、VPg和CP 3个基因联合序列分析显示,FQ01分离物与PVY株系的核苷酸序列一致性最高,FQ08分离物与PVYE株系的核苷酸序列一致性最高,CL01、CL02、CL05和CL13 4个分离物与PVY株系SYR-I型的核苷酸序列一致性最高,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12 7个分离物与PVY株系SYR-II型的核苷酸序列一致性最高。重组分析显示,除CP基因外,长乐市和福清市两个产区的PVY分离物的P1和VPg基因中均检测到显著的重组信号。基因型统计分析结果显示,长乐产区的P1基因为N型(60%)和N×O重组型(40%),VPg基因均为N×O重组型,而CP基因均为O型,而福清产区的P1基因为N型(25%)和N×O重组型(75%),VPg基因为N×O重组型(87.5%)和O型(12.5%),而CP基因除了一个分离物为N型外,其他均为O型。系统发育分析显示分离物FQ01与PVYN-Wi株系聚为一簇,FQ08与PVYE株系聚为一簇,CL01、CL02、CL05和CL13与PVY株系SYR-I型聚为一簇,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12与PVY株系SYR-II型聚为一簇,表明在系统发育关系上,分离物FQ01与PVYN-Wi株系最近,FQ08与PVYE株系最近,CL01、CL02、CL05和CL13与PVY株系SYR-I型最近,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12与PVY株系SYR-II型最近。【结论】PVY在福建省长乐市、福清市马铃薯种植区普遍存在,重组株系已成为田间的主流株系,且PVY已成为优势重组株系。

关键词：马铃薯Y病毒 ELISA 多基因联合序列系统发育重组株系

马铃薯Y病毒pipo基因的分子变异及结构特征分析

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遗传 2013年第9期35卷 1125-1134页

作者：高芳銮沈建国史凤阳常飞谢联辉詹家绥福建农林大学植物病毒研究所福建省植物病毒学重点实验室福州350002 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心福州350001

为揭示马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）pipo基因的分子变异和结构特征,文章根据文献报道的马铃薯Y病毒属（Potyvirus）pipo基因保守区序列设计一对简并引物,从感染PVY的马铃薯病叶中克隆获得pipo基因的cDNA全长序列,分析其核苷酸序... 详细信息

为揭示马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）pipo基因的分子变异和结构特征,文章根据文献报道的马铃薯Y病毒属（Potyvirus）pipo基因保守区序列设计一对简并引物,从感染PVY的马铃薯病叶中克隆获得pipo基因的cDNA全长序列,分析其核苷酸序列和氨基酸序列的特征,并基于氨基酸序列使用贝叶斯法重建了Potyvirus的系统发育树。结果显示：20个PVY分离物成功扩增出预期大小（约235bp）的特异性片段,其核苷酸序列与已报道的其它PVY株系的pipo基因核苷酸序列一致性均在92%以上;5′端均含有典型的G1-2A6-7基序（motif）,无碱基插入/缺失,所有的核苷酸变异都是碱基置换,共发现13个多态性位点,其中4个简约信息位点,9个单一变异位点,表明该基因高度保守,但不同分离物也存在一定的分子变异;PIPO蛋白理论等电点11.26~11.62,无信号肽和跨膜区,是可溶的亲水性蛋白;整个蛋白含有3个保守区,其中位于10~59aa的基序最为保守。该蛋白主要定位于线粒体中,可能是线粒体导肽。系统发育分析结果显示,源于PVY不同株系优先相聚成簇,而向日葵褪绿斑驳病毒（Sunflower chlorotic mottle virus,SuCMoV）与辣椒重花叶病毒（Pepper severe mosaic virus,PepSMV）的亲缘关系较PVY相比更近,与前人的结果相一致,表明PIPO蛋白可以作为研究Potyvirus系统发育关系的新的分子标记。

关键词：马铃薯Y病毒 pipo基因病毒进化

水稻DEAD-box RNA解旋酶OsRH37超表达和RNAi转基因水稻的获得及其亚细胞定位分析

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农业生物技术学报 2015年第11期23卷 1410-1420页

作者：张超高芳銮郑璐平丁作美杨振李阳吴建国吴祖建福建农林大学植物病毒研究所/福建省植物病毒学重点实验室

DEAD-box RNA解旋酶(RNA helicase,RH)普遍存在于绝大多数的生物体中,参与到RNA新陈代谢的各个方面。本研究从日本晴水稻(Oryza sativa ***)叶片RNA中成功克隆DEAD-box RNA解旋酶基因Os RH37的CDS全长序列。序列比对发现,Os RH37的氨基... 详细信息

DEAD-box RNA解旋酶(RNA helicase,RH)普遍存在于绝大多数的生物体中,参与到RNA新陈代谢的各个方面。本研究从日本晴水稻(Oryza sativa ***)叶片RNA中成功克隆DEAD-box RNA解旋酶基因Os RH37的CDS全长序列。序列比对发现,Os RH37的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)DEAD-box RNA解旋酶17、37和52的氨基酸序列一致性>70%,与来自于不同动物体内DEAD-box RNA解旋酶的氨基酸序列一致性普遍<60%。构建了Os RH37的水稻超表达和RNAi干扰载体,通过水稻遗传转化体系成功转化水稻获得Os RH37超表达和RNAi T0转基因水稻阳性植株。sq RT-PCR分析表明,与野生型日本晴水稻中Os RH37表达量相比,Os RH37超表达T1转基因水稻中Os RH37表达量均明显上调,而Os RH37 RNAi转基因水稻中Os RH37的表达量均显著下调。构建青色荧光蛋白的瞬时表达载体CFP-Os RH37,经农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)接种导入本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片表皮细胞,激光共聚焦显微观察结果显示,Os RH37蛋白定位于细胞核、染色质核仁和细胞质中的点状结构。Os RH37的生物信息学分析、超表达和RNAi转基因水稻的获得以及亚细胞定位分析将为研究其在水稻生长发育和胁迫反应中发挥的重要作用提供线索。

关键词： DEAD-box RNA解旋酶(RH) OsRH37 超表达 RNAi 亚细胞定位