水稻瘤矮病毒P8、Pns10基因的原核表达及生物信息学分析

作     者：高芳銮 

作者单位：福建农林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴祖建

授予年度：2006年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：水稻瘤矮病毒 原核表达 抗血清 生物信息学 结构域 系统发育 

摘      要：为了深入研究水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus，RGDV)P8、Pns10蛋白的功能，本文对RGDV P8、Pns10蛋白进行了生物信息学分析，并开展了P8、Pns10蛋白的原核表达及抗血清制备。 通过RT-PCR技术成功地扩增到RGDV中国广东信宜分离物(RGDV-C)P8、Pns10基因，并克隆到pMD18T载体上，双酶切重组质粒后，分别将目的片段转入pGEX-4T-1表达载体，转化大肠杆菌***(DE3)，筛选获得阳性重组子pGTP8、pGTPns10，序列测定表明目的基因准确地插入到表达载体的BamH I／Xho I位点。经IPTG诱导分别表达出74kD、62kD的融合蛋白，SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量与预期的pGTP8融合蛋白、pGTPns10融合蛋白分子量相符。将获得的pGTP8、pGTPns10融合蛋白免疫大耳白兔制备了专化性抗血清，间接ELISA测定P8、Pns10抗血清效价分别为1：9600、1：8192，Westem-blotting印迹分析表明所制备的P8、Pns10抗血清特异性强。 借助生物学软件及相关在线分析工具对测序完成的RGDV P8、Pns10基因进行基于氨基酸序列的生物信息学分析，包括蛋白质理化特性、蛋白质功能域、基序(Motif)、空间结构等，分析表明除P8蛋白含有一个26个氨基酸长度的跨膜区外，两个蛋白均无信号肽、卷曲螺旋等功能区特征。功能域分析表明P8蛋白是Phytoreo P8家族中的一个成员，该家族蛋白的功能在Interpro上注释为结构分子活性，Pns10蛋白属于蛋白质家族Phytons90成员，该蛋白家族功能未知。本文还利用邻接法(Neibor-Joining，NJ)和最大似然法(Maximum Likehood，ML)分别构建呼肠孤病毒科系统发育树，分析结果很好支持了该科的分类地位。