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鸽圆环病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2024年

作者：杨颖路文彬向凤君雷白时赵款安峥张武超袁万哲保定市久盟生物科技有限公司河北农业大学动物医学院

为建立一种检测鸽圆环病毒(pigeon circovirus，PiCV)抗体的间接ELISA方法，本研究将大小为828 bp的PiCV Cap基因片段克隆至载体pGEX-4T-1，通过低温诱导获得了可溶性Cap重组蛋白，经Western-blot验证后发现，该重组蛋白与抗GST标签抗... 详细信息

为建立一种检测鸽圆环病毒(pigeon circovirus，PiCV)抗体的间接ELISA方法，本研究将大小为828 bp的PiCV Cap基因片段克隆至载体pGEX-4T-1，通过低温诱导获得了可溶性Cap重组蛋白，经Western-blot验证后发现，该重组蛋白与抗GST标签抗体和抗Cap蛋白抗体均可发生特异性反应。利用纯化的Cap重组蛋白作为包被抗原，通过棋盘滴定法优化各反应条件，建立了PiCV抗体间接ELISA检测方法。结果显示，最佳抗原包被浓度为0.25 mg/L，5%BSA作为封闭液37 ℃孵育2 h，待检血清最佳稀释度为1∶800，孵育时间为45 min，家兔抗鸽IgG-HRP二抗最佳稀释度为1∶8 000，孵育时间为30 min，最佳显色时间为15 min，当检测样品D450≥0.341则判定其为阳性。用该方法检测鸽腺病毒、鸽疱疹病毒、鸽Ⅰ型副黏病毒和轮状病毒的阳性血清时结果呈阴性，对稀释至1∶12 800的阳性血清进行检测时结果仍为阳性，批内和批间变异系数均小于10%。与常规PCR符合率为88.2%，用该方法对86份临床血清样品进行检测，阳性率为17.4%。综上所述，该间接ELISA方法的建立，作为一种特异性强，灵敏度高，重复性好的血清学检测方法，为后续PiCV候选疫苗免疫后抗体水平的评价及PiCV感染状况的评估提供了技术支持。

关键词：鸽圆环病毒 Cap蛋白原核表达间接ELISA方法

稳定表达GM-CSF的重组塞内卡病毒A构建与鉴定

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中国兽医学报 2023年

作者：郭笑然韩颖刘帅峰刘小娜雷白时张武超赵款袁万哲河北农业大学动物医学院河北省兽医生物技术创新中心

塞内卡病毒A（SenecavirusA，SVA）是近年来新发的一种能够引起猪水疱性相关疾病的病毒，该病毒在我国流行范围越来越广，对养猪业造成了巨大经济损失。为提高灭活疫苗的免疫效果，本研究以SVA感染性克隆为基础，将猪源GM-CSF-T2A基因... 详细信息

塞内卡病毒A（SenecavirusA，SVA）是近年来新发的一种能够引起猪水疱性相关疾病的病毒，该病毒在我国流行范围越来越广，对养猪业造成了巨大经济损失。为提高灭活疫苗的免疫效果，本研究以SVA感染性克隆为基础，将猪源GM-CSF-T2A基因通过融合PCR方法插入到SVA的2A和2B之间，成功构建了重组质粒SVA-GM-CSF，将其转染BHK-21细胞进行病毒拯救及传代。结果显示重组病毒感染BHK-21细胞可以引起明显的细胞病变；经RT-PCR扩增与基因测序结果表明目的基因正确插入；间接免疫荧光鉴定表明外源基因GM-CSF在该病毒中成功获得了表达。生物学特性分析表明重组病毒与亲本病毒在BHK-21细胞中具有相似的生长特性，并且该重组病毒在传代过程中具有良好的遗传稳定性。本研究已成功构建了稳定表达GM-CSF的重组SVA，该重组病毒的构建为进一步明确SVA致病机制和研制新型疫苗提供了理论支持与技术指导。

关键词：塞内卡病毒A 感染性克隆 GM-CSF 重组病毒

西瓜枯萎病拮抗芽孢杆菌HD-5菌株的筛选与发酵工艺

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西瓜枯萎病拮抗芽孢杆菌HD-5菌株的筛选与发酵工艺

作者：雷白时河北农业大学

学位级别：硕士

西瓜枯萎病又叫蔓割病,是一种世界性分布的土传病害,是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的。西瓜枯萎病的田间发病率一般为10%-30%,特别是重茬瓜田的发病率尤为严重,减产20%-50%,甚至绝收,造成了巨大的经济损失。目前,从土壤中... 详细信息

西瓜枯萎病又叫蔓割病,是一种世界性分布的土传病害,是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的。西瓜枯萎病的田间发病率一般为10%-30%,特别是重茬瓜田的发病率尤为严重,减产20%-50%,甚至绝收,造成了巨大的经济损失。目前,从土壤中筛选拮抗微生物来防治病害逐渐成为研究的热点课题。本研究旨在筛选到对西瓜枯萎病菌尖孢镰刀菌具有较好生物防治潜力的拮抗芽孢细菌,并对其进行相关研究,以便在西瓜种植业中用于西瓜枯萎病的防治。对土样中分离的产芽孢细菌进行初筛和复筛,得到3株具有较强抑菌活性的拮抗芽孢细菌HD-5、CZ-10、BY-1菌株,并对该3菌株进行了实验室西瓜枯萎病盆栽防治效果试验,最终获得了对西瓜枯萎病具有较好防治效果的拮抗芽孢细菌HD-5菌株。通过对HD-5菌株的形态特征、生理生化特征考察,以及16S rDNA全序列分析表明HD-5菌株与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的生理生化特征相符,与其16S rDNA序列同源性高达99.78%的。因此,判定HD-5菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。通过对B. amyloliquefaciens HD-5菌株抗菌物质的性质分析,初步确定其分泌的抗菌物质为蛋白质或多肽;为了提高HD-5菌株发酵产抑菌活性物质的量,采用单因素法对HD-5菌株发酵培养基所需的碳源、氮源、无机盐进行了筛选,并采用正交试验对HD-5菌株的发酵培养基组成及培养条件进行了优化,最终确定产抑菌活性物质的最适发酵培养基及培养条件为:葡萄糖5.0%,大豆蛋白胨5.0%,MnSO4 0.05%,MgSO4·7H2O 0.05%,培养基初始pH7.5,种龄14-16 h,接种量8%,于30℃、200 r/min摇床培养48 h。经过优化拮抗细菌HD-5菌株的发酵产抑菌活性物质能力大大提高了,抑菌圈直径增加了65.0%。为了提高B. amyloliquefaciens HD-5菌株的芽孢形成率及芽孢数量,奠定芽孢菌剂的工业化生产基础,用摇瓶发酵对芽孢形成的主要影响因素进行了考察。通过单因素实验和正交实验对HD-5菌株产芽孢条件进行了分析,确定了摇瓶产芽孢最佳条件为:玉米粉0.5%,大豆蛋白胨0.5%,MgSO4·7H2O 0.05%,MnSO4 0.05%,初始pH 7.5,接种量5%,于37℃、180 r/min摇床培养48 h,最终可使HD-5菌株的芽孢形成率达到89.62%,生物量为1.2×10~9 cfu/mL。为了进行B. amyloliquefaciens HD-5菌株芽孢菌剂的田间应用试验与最终推广应用,研究HD-5菌株的大型发酵工艺参数,在2 m3发酵罐进行了产芽孢试生产,确立了该菌株在2 m3发酵罐中的发酵工艺参数。经过发酵,发酵液菌浓达到1.0×109 cfu/mL,芽孢形成率在85.0%以上。最后经过添加锯末固定、干燥,制备出的固体菌剂为140 kg。经过测定,其活菌含量为7.0×10~9 cfu/g。

关键词：西瓜枯萎病拮抗细菌解淀粉芽孢杆菌筛选鉴定发酵

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羊干扰素α和γ融合表达及抗病毒活性分析

中国兽医学报 2023年第4期43卷 660-667页

作者：韩颖李秀丽豆子航郭笑然雷白时袁万哲赵款河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省兽医生物技术工程技术创新中心河北保定071001

为进一步探究羊干扰素α和γ的抗病毒活性效果,根据GenBank羊IFN-α和IFN-γ基因序列,使用Linker连接合成目的序列,成功构建了3种重组表达质粒pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α、pET28a-OviIFN-γ/α并进行原核表达。用细胞病变抑制... 详细信息

为进一步探究羊干扰素α和γ的抗病毒活性效果,根据GenBank羊IFN-α和IFN-γ基因序列,使用Linker连接合成目的序列,成功构建了3种重组表达质粒pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α、pET28a-OviIFN-γ/α并进行原核表达。用细胞病变抑制法和RT-qPCR测定重组蛋白rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ的抗病毒活性。结果表明,rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ在牛肾细胞(MDBK)以及非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞中有抗病毒活性,且rOviIFN-α/γ的抗病毒效果最优;rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ能够显著上调MDBK以及Vero细胞中4种干扰素刺激基因(IFN stimulated genes,ISGs)的mRNA转录水平,且rOviIFN-α/γ对干扰素刺激基因的上调水平最显著。综上所述,本试验表达的重组蛋白都具有抗病毒作用,其中串联表达的重组蛋白抗病毒活性以及干扰素刺激基因转录水平较高。

关键词：羊干扰素α和γ 细胞病变抑制融合表达抗病毒活性干扰素刺激基因

新型鹅细小病毒感染鸭的肝、胸腺、回肠转录组差异表达分析

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畜牧兽医学报 2022年第2期53卷 654-657页

作者：王璐瑶郝雪飘雷白时赵款张武超袁万哲河北农业大学动物医学院保定071001 河北省兽医生物技术创新中心保定071001

旨在探究新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus,NGPV)与宿主细胞相互作用的分子致病机制。本研究采用转录组测序技术对感染NGPV SD株14 d雏鸭的肝、胸腺和回肠进行分析。结果显示:感染组回肠上调基因有78个,下调基因有31个;感染组胸... 详细信息

旨在探究新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus,NGPV)与宿主细胞相互作用的分子致病机制。本研究采用转录组测序技术对感染NGPV SD株14 d雏鸭的肝、胸腺和回肠进行分析。结果显示:感染组回肠上调基因有78个,下调基因有31个;感染组胸腺上调基因有111个,下调基因有78个;感染组肝中上调基因有128个,下调基因有313个;NGPV感染雏鸭后,胸腺、回肠和肝中的差异表达基因参与免疫效应过程、淋巴细胞介导的免疫等多个免疫相关生物学过程,并在Toll样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、NF-κB信号通路、PI3K-Akt信号等多条信号通路富集。综上表明:NGPV感染激活了机体免疫反应和宿主细胞的相关抗病毒信号通路。此研究为NGPV的致病机制研究提供了新的线索。

关键词：新型鹅细小病毒短喙侏儒综合征转录组测序免疫反应

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重组猪干扰素α的原核表达及抗病毒活性

中国兽医学报 2023年第2期43卷 245-252页

作者：李秀丽韩颖赵款张武超梁飞杨欢雷白时袁万哲河北农业大学河北保定071001 河北省兽医生物技术创新中心河北保定071001 石家庄市动物基因工程药物技术创新中心河北石家庄050800 河北伯瑞动物药业有限公司河北正定050800 山东省莒南县动物疫病预防控制中心山东莒南276600

为了探究重组猪干扰素(PoIFN-α)在体内外的抗病毒活性,利用pET-32a载体系统,构建了PoIFN-α的原核表达体系。在体外,MTT法在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)上测定了其细胞毒性,并利用细胞病变抑制法测定其抗水泡性口炎病毒(VSV)、猪... 详细信息

为了探究重组猪干扰素(PoIFN-α)在体内外的抗病毒活性,利用pET-32a载体系统,构建了PoIFN-α的原核表达体系。在体外,MTT法在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)上测定了其细胞毒性,并利用细胞病变抑制法测定其抗水泡性口炎病毒(VSV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的活性,同时测定了重组蛋白作用PK-15细胞后干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平;之后通过小鼠攻毒保护试验,测定了rPoIFN-α治疗后各组织器官的病毒载量,ELISA测定了小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的动态变化,并对整个试验期间小鼠出现的临床症状进行打分。结果显示,成功获得了原核表达的特异性重组蛋白rPoIFN-α,在细胞上抗病毒比活性达到1.67×10^(6)IU,对细胞没有损害作用,且显著上调了Mx1、OAS等因子的转录水平;在小鼠体内能明显拮抗EMCV和PRV的增殖,减少促炎因子的产生,延缓临床症状的出现。结果表明,原核表达重组蛋白rPoIFN-α在体内外均具有抗病毒活性,为进一步推进蛋白药物在临床上的应用奠定了基础。

关键词：重组猪干扰素α 大肠杆菌表达干扰素刺激基因细胞毒性抗病毒活性

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猪圆环病毒体外高效增殖研究进展

中国兽医学报 2023年第4期43卷 812-817页

作者：雷白时薛拥志李秀丽包银莉张武超赵款袁万哲河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省人畜共患病原微生物分析与防控重点实验室河北保定071001 河北北方学院动物科技学院河北张家口075131 龙岩学院预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室福建龙岩364012

猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus diseases,PCVDs)主要通过疫苗产品进行预防,病毒增殖水平与疫苗研发密切相关,随着新发病原PCV3和PCV4的出现和广泛流行,对于实现此类病毒体外高效增殖,已经成为开展相应病毒病原学、发病机制及... 详细信息

猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus diseases,PCVDs)主要通过疫苗产品进行预防,病毒增殖水平与疫苗研发密切相关,随着新发病原PCV3和PCV4的出现和广泛流行,对于实现此类病毒体外高效增殖,已经成为开展相应病毒病原学、发病机制及其疫苗研究方面的瓶颈。鉴于4种猪圆环病毒(PCV)在基因组结构、复制机制等方面的相似性,现对其中已实现体外培养的PCV2,在促进其病毒增殖方面的方法和研究进展进行总结和概括,以期进一步提升现有PCV2增殖水平,并对实现PCV3或PCV4的体外培养提供助力,从而促进PCV疫苗的研发和相关病原学与发病机制的深入研究。

关键词：猪圆环病毒体外培养病毒增殖研究进展

稳定表达GM-CSF的重组塞内卡病毒A的构建与鉴定

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中国兽医学报 2023年第10期43卷 2013-2019页

作者：郭笑然韩颖刘帅峰刘小娜雷白时张武超赵款袁万哲河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省兽医生物技术创新中心河北保定071001

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是近年来新发现的一种能够引起猪水疱性相关疾病的病毒,该病毒在我国流行范围越来越广,对养猪业造成了巨大经济损失。为提高灭活疫苗的免疫效果,本研究以SVA感染性克隆为基础,将猪源GM-CSF-T2A基因通过融... 详细信息

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是近年来新发现的一种能够引起猪水疱性相关疾病的病毒,该病毒在我国流行范围越来越广,对养猪业造成了巨大经济损失。为提高灭活疫苗的免疫效果,本研究以SVA感染性克隆为基础,将猪源GM-CSF-T2A基因通过融合PCR方法插入到SVA的2A和2B之间,成功构建了重组质粒SVA-GM-CSF,将其转染BHK-21细胞进行病毒拯救及传代。结果显示,重组病毒感染BHK-21细胞可以引起明显的细胞病变;经RT-PCR扩增与基因测序结果表明目的基因正确插入;间接免疫荧光鉴定表明外源基因GM-CSF在该病毒中成功获得了表达。生物学特性分析表明,重组病毒与亲本病毒在BHK-21细胞中具有相似的生长特性,并且该重组病毒在传代过程中具有良好的遗传稳定性。本研究已成功构建了稳定表达GM-CSF的重组SVA,该重组病毒的构建为进一步明确SVA致病机制和研制新型疫苗提供了理论支持与技术指导。

关键词：塞内卡病毒A 感染性克隆 GM-CSF 重组病毒

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手性磷霉素转化菌株的筛选

安徽农业科学 2010年第29期38卷 16127-16128,16130页

作者：王笑颖雷白时河北农业大学农学院河北保定071001 河北农业大学生命科学学院河北保定071001

[目的]从土壤中筛选出能将无抑菌活性的右旋磷霉素转化为有抑菌活性的左旋磷霉素的链霉菌菌株。[方法]用平板稀释法从土样中分离链霉菌,再将获得的链霉菌接种在含有右旋磷霉素的发酵培养基中进行摇瓶培养,取上清液采用纸片法进行生物检... 详细信息

[目的]从土壤中筛选出能将无抑菌活性的右旋磷霉素转化为有抑菌活性的左旋磷霉素的链霉菌菌株。[方法]用平板稀释法从土样中分离链霉菌,再将获得的链霉菌接种在含有右旋磷霉素的发酵培养基中进行摇瓶培养,取上清液采用纸片法进行生物检测。[结果]通过对抑菌圈产生情况的分析,初步确认从土样中分离获得的121株链霉菌中有4株能将无抑菌活性的右旋磷霉素转化为有抑菌活性的左旋磷霉素。[结论]该研究为工业上磷霉素的转化利用提供了一定的理论基础。

关键词：磷霉素转化链霉菌筛选