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作者：蓝开健南方医科大学

学位级别：硕士

肾细胞癌又称肾癌,是成人最常见的肾脏肿瘤,可见于各个年龄段,高发年龄50-70岁。在我国,肾肿瘤在泌尿外科肿瘤中占第二位,仅次于膀胱肿瘤。且肾癌对放疗、化疗效果不明显副作用大。由于其起病隐匿,诊断时有一部分已发生转移。即使是局... 详细信息

肾细胞癌又称肾癌,是成人最常见的肾脏肿瘤,可见于各个年龄段,高发年龄50-70岁。在我国,肾肿瘤在泌尿外科肿瘤中占第二位,仅次于膀胱肿瘤。且肾癌对放疗、化疗效果不明显副作用大。由于其起病隐匿,诊断时有一部分已发生转移。即使是局限性肾癌,采用根治性切除术后仍有近30%患者会复发。因此,全身转移性肾癌及肾癌术后复发的治疗成为泌尿外科研究的重点和难点。随着研究深入,发现肾癌多存在VHL-HIF-VEGF信号通路。因此,抑制或阻断VHL-HIF-VEGF信号通路,特别是阻断VEGF或其受体VEGFR,就可能抑制肾癌的生长。贝伐单抗(Bevacizumab)是VEGF特异性抗体,是经过人源化改造的鼠源抗体,与VEGF特异性结合并阻断其生物活性。2007年12月美国FDA批准转移性肾癌的一线治疗方案其中就有贝伐单抗联合IFN-α的靶向治疗。然而,通过杂交瘤技术获得的鼠源单抗经过人源化改造,不可能完全去除抗体的免疫原性,且抗体空间构型可能发生改变,亲和力往往会降低,在临床上表现为小剂量疗效有限,大剂量或联合用药导致副反应增加的问题。目前常用噬菌体展示技术、核糖体展示技术、酵母菌展示技术在内的常用的人源抗体展示技术,都没有或者有着与哺乳动物细胞不同的蛋白质折叠和转录后修饰功能,所以其所展示的抗体不能形成正确的三级结构,亲和力不高,表达及纯化难度大,且只能筛选到抗体片段(单链抗体可变区片段scFv或者抗原结合片段Fab)而非全长抗体。为了克服以上抗体制作的不足,研究者尝试利用哺乳动物细胞表面抗体展示技术筛选人源抗体。迄今为止,哺乳动物细胞表面展示技术所构建抗体库的库容量多局限于104-106,筛选抗体多样性不足,难以满足筛选高亲和力抗体的要求。为了克服上述抗体筛选技术存在的不足,本课题组对现有的哺乳动物细胞展示技术作了技术改良。为了提高筛选到特异性抗VEGF抗体的几率,本实验应用来自于肾癌及自身免疫病患者的外周血淋巴细胞(PBMC)为材料构建抗体库。通过提取患者PBMC的总RNA,进行RT-PCR扩增全套抗体基因,随后使用哺乳动物细胞表达载体pDGB-HC-TM,构建了两个全长人源抗体基因库,库容量达到1010以上。为了提高筛选到特异性抗VEGF抗体的成功率,充分利用贝伐单抗的抗VEGF导向选择作用,本课题通过全基因方法合成了贝伐单抗的轻、重链可变区基因,分别与上述构建好的两个全长人源的抗体库配对,通过四片段连接的方法插入双表达载体pDGB4,构建两个二级抗体库。并构建了用于表达贝伐单抗的阳性对照载体pDGB4-avastin。然后将其稳定转染FCHO细胞,成功构建能稳定展示全长抗体的哺乳动物细胞库。利用流式细胞分选技术,我们能从构建的细胞库中筛选到在细胞表面稳定展示能与VEGF抗原结合的抗体的FCHO细胞。通过两轮的富集,可结合VEGF抗原的阳性细胞分别增加20.7倍和7.8倍;随后利用流式细胞分选术进行了单细胞分选,获得了轻链18株、重链8株可结合VEGF抗原的单克隆细胞。为进一步获得全长人源抗VEGF抗体奠定了基础。一、全长人源初级抗体库的构建及展示目的：采用哺乳动物表面展示技术构建全长人源初级抗体库。方法：1.外周血淋巴细胞的分离及总RNA的提取采集患者静脉血,置入抗凝管中,采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞,加入Buffer RLT,裂解细胞,一80℃冰箱保存备用或者直接用于提取总RNA。***第一链的合成以总RNA为模板,根据V-BASE网站信息所设计合成的全套人抗体重链可变区引物和全套人抗体轻链恒定区引物,逆转录合成cDNA第一条链。3.全套IgG1重链可变区基因和轻链K型全长基因的扩增以合成的cDNA为模板,用对应的特异性引物扩增全套IgG1轻链κ型全长基因及全套IgGl重链可变区基因(3套轻链引物,3套重链引物)。PCR条件为：94℃预变性5分钟,然后进行35个循环的PCR扩增(94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min),随后在延长温度下反应7min,以确保全长目的片段的合成。***扩增产物的分离纯化用PCR扩增抗体重链可变区基因和全套Kappa轻链。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段。5.重链抗体基因库及轻链基因库的构建及鉴定用BsmBI对PCR扩增的重链基因产物及载体pDGB-HC-TM进行酶切,电泳分析并回收目的片段,将回收的载体片段和抗体基因片段用T4DNA连接酶按1：1进行连接,16℃反应24h后,化学转化感受态大肠杆菌TOPO-10,构建重链基因库。用SfiI酶切轻链全长基因和载体pDGB-HC-TM,电泳回收目的DNA片段,

关键词：肾癌抗VEGF抗体全长抗体人源抗体抗体筛选哺乳动物细胞表面展示

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经尿道膀胱肿瘤电切术和开放手术治疗膀胱肿瘤的疗效对比

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智慧健康 2022年第1期8卷 65-67,71页

作者：蓝开健汕头市中心医院泌尿外科广东汕头515000

目的探讨膀胱肿瘤患者接受开放手术、经尿道膀胱肿瘤电切术(TURBT)的临床治疗效果。方法纳入2017年1月-2018年12月汕头市中心医院收治的298例患者,所有患者均被确诊为膀胱肿瘤,其中接受经TURBT的患者有248例,设为研究组;接受开放手术治... 详细信息

目的探讨膀胱肿瘤患者接受开放手术、经尿道膀胱肿瘤电切术(TURBT)的临床治疗效果。方法纳入2017年1月-2018年12月汕头市中心医院收治的298例患者,所有患者均被确诊为膀胱肿瘤,其中接受经TURBT的患者有248例,设为研究组;接受开放手术治疗的患者有50例,设为对照组;对比两种手术治疗的临床效果。结果研究组患者的手术时间、术中出血量、留置导尿管时间、住院时长均低于对照组,(P0.05),治疗后,两组KPS评分均上升(P开放手术治疗,患者的预后效果更佳,并发症少,该手术治疗方法值得推广。

关键词：经尿道膀胱肿瘤电切术开放手术膀胱肿瘤临床疗效并发症发生率

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鱼的摄入与肾癌发病风险关系的Meta分析

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南方医科大学学报 2013年第5期33卷 772-775页

作者：万沛李妍李飞马天骏蓝开健陈炜陈三三何成武谭万龙南方医科大学南方医院泌尿外科南方医科大学临床医学八年制广东广州510515

目的应用meta分析的方法对各项研究进行系统分析以研究鱼的摄入与肾癌发病风险关系。方法在PubMed,Embase,CNKI,CA中检索有关鱼及其产品的摄入与肾癌关系的病例对照研究以及队列研究的文献。通过meta分析方法研究鱼的摄入与肾癌的关系... 详细信息

目的应用meta分析的方法对各项研究进行系统分析以研究鱼的摄入与肾癌发病风险关系。方法在PubMed,Embase,CNKI,CA中检索有关鱼及其产品的摄入与肾癌关系的病例对照研究以及队列研究的文献。通过meta分析方法研究鱼的摄入与肾癌的关系。运用I^2检验各项研究的异质性,并使用漏斗图检验发表偏倚。结果共纳入17篇文献,采用随机效应模型合并分析后的结果未发现鱼的摄入与肾癌的发病风险相关(RR=0.90;95%CI,0.78～1.02)且异质性明显(P=0.003,I^2=52.3%),针对研究类型、研究地区以及发表时间进行亚组分析,同样没有明显的证据证明两者相关,但在性别亚组的分析中发现,男性增加鱼的摄入可降低肾癌的发病率,而在女性中则没有关系。结论 meta分析结果提示增加鱼的摄入未发现有预防肾癌发病的作用。

关键词：肾癌鱼 meta分析

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应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库

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南方医科大学学报 2013年第6期33卷 847-852页

作者：温扬明蓝开健王俊洁余晶仪屈娅荣赵卫张复春谭万龙曹虹周辰南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系广州市第八人民医院感染科广东广州510060 中医药学院广东广州510515 杭州环捷科技有限公司浙江杭州311400

目的应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库。方法采集登革确诊患者恢复期外周血,分离外周血淋巴细胞并提取其总RNA,用RT-PCR扩增全长Kappa轻链(LCκ)和重链可变区(VH)基因,构建抗体轻链基因库和抗体重链... 详细信息

目的应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库。方法采集登革确诊患者恢复期外周血,分离外周血淋巴细胞并提取其总RNA,用RT-PCR扩增全长Kappa轻链(LCκ)和重链可变区(VH)基因,构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库;将抗体基因库转染CHO细胞、用流式细胞仪分析抗体在CHO细胞表面的表达。结果以1.2μg总RNA为模板,用6套引物扩增全长Kappa轻链和重链可变区基因,插入表达载体,轻链基因库容量为1.45×104,重链基因库容量为1.8×105;随机挑选的10个轻链克隆和10个重链克隆,经过测序鉴定,轻链有8个含有正确的阅读框架,编码8个不同的氨基酸序列,重链有7个含有正确的阅读框架,编码7个不同的氨基酸序列。流式细胞仪分析含有正确阅读框架的单克隆和抗体基因库,均检测到全长抗体在CHO细胞表面的表达,抗体库中可表达的抗体多样性达到109。结论以1.2μg总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,成功构建可表达库容量达到109的登革病毒特异性全长人抗体基因库。

关键词：登革病毒哺乳动物细胞表面展示全长人源抗体库

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采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源膀胱癌特异性抗体基因库

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南方医科大学学报 2013年第5期33卷 684-691页

作者：蓝开健张哲欢梁中锟王俊洁娄海波周元平刘叔文李长征谭万龙周辰南方医科大学南方医院南方医科大学汕头市中心医院广东汕头515000 南方医科大学药学院南方医科大学中医药学院广东广州510515 南方医科大学杭州环捷科技有限公司浙江富阳311400

目的构建大容量且能高效展示于哺乳动物细胞表面的全长人源膀胱癌特异性抗体基因库。方法分离膀胱癌患者的外周血单核细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,用RT-PCR方法扩增全套IgG1重链可变区(VH)和Kappa型轻链全长(LCκ)基因,经过相应的限制... 详细信息

目的构建大容量且能高效展示于哺乳动物细胞表面的全长人源膀胱癌特异性抗体基因库。方法分离膀胱癌患者的外周血单核细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,用RT-PCR方法扩增全套IgG1重链可变区(VH)和Kappa型轻链全长(LCκ)基因,经过相应的限制性内切酶酶切后分别插入pDGB-HC-TM载体,分别构建膀胱癌特异性的抗体重链基因库和轻链基因库(一级抗体库)。随机挑取20个单克隆测定抗体基因序列,并瞬时转染FCHO细胞,结合流式细胞仪检测细胞表面抗体的表达。将上述构建好的轻重链基因库通过4片段连接方法插入双表达载体pDGB4,构建二级抗体库,转染FCHO后用流式细胞仪检测细胞表面抗体表达。结果分别成功构建了膀胱癌特异性的重链基因库和轻链基因库,随机挑取的轻重链单克隆各有7个和9个含有正确的抗体基因编码序列,且能展示于哺乳动物细胞表面,理论库容量达到3.32×10^(11)[(1.7×10~6×70%)×(3.1×10~5×90%)]。成功构建了膀胱癌二级抗体库,库容量为9×10~5。结论利用哺乳动物细胞表面展示技术,我们成功构建了膀胱癌特异性的全长人源抗体基因库,一级抗体库的库容量达到3.32×10^(11),二级抗体库库容量达到9×10~5,为下一步筛选特异性、高亲和力抗膀胱癌抗体奠定了基础。

关键词：膀胱癌哺乳动物细胞表面展示全长人源抗体流式细胞仪检测

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IL-21膜表面修饰MB49细胞疫苗治疗小鼠转移性膀胱癌的实验研究

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南方医科大学学报 2012年第6期32卷 807-811页

作者：彭俊铭石小军陈定南梁中锟蓝开健高基民谭万龙南方医科大学南方医院泌尿外科广东广州510515 温州医学院生命科学学院//浙江医学遗传学省级重点实验室浙江温州325035

目的制备白细胞介素21(IL-21)膜表面修饰的小鼠膀胱癌MB49细胞疫苗,评价其在小鼠膀胱癌皮下转移模型中诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL s)的效应和治疗作用。方法将SA-IL-21锚定在经30%酒精灭活后的MB49细胞膜表面而制成IL-21膜表面修... 详细信息

目的制备白细胞介素21(IL-21)膜表面修饰的小鼠膀胱癌MB49细胞疫苗,评价其在小鼠膀胱癌皮下转移模型中诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL s)的效应和治疗作用。方法将SA-IL-21锚定在经30%酒精灭活后的MB49细胞膜表面而制成IL-21膜表面修饰疫苗。建立C57BL/6小鼠皮下MB49膀胱癌模型,将荷瘤小鼠随机分为5组:IL-21膜表面修饰疫苗组、单纯游离IL-21组、GFP膜表面修饰疫苗组、单独灭活MB49肿瘤疫苗组、PBS组。利用上述制备的疫苗进行治疗,通过检测各组小鼠肿瘤体积变化及CTL来评价疫苗的抗肿瘤功能。结果成功制备了IL-21膜表面修饰MB49疫苗。IL-21/MB49疫苗可显著抑制肿瘤生长并产生长期特异性免疫反应(P<0.05)。在同一效靶比下IL-21/MB49疫苗组的CTL杀伤活性显著高于其他组(P<0.05)。结论采用蛋白膜锚定技术可将IL-21高效锚定于MB49细胞膜表面制备成IL-21膜表面修饰膀胱癌肿瘤疫苗,该疫苗既可保持IL-21生物学活性又可明显增强CTL杀伤BCa肿瘤活性。

关键词：转移性膀胱癌肿瘤疫苗免疫治疗白介素21 膜表面修饰

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经皮膀胱造瘘术后行TURP治疗中老年重度前列腺增生的疗效分析

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中外医疗 2021年第18期40卷 36-39页

作者：蓝开健洪旭伟陈少川汕头市中心医院泌尿外科广东汕头515000

目的观察经皮膀胱造瘘术后行经尿道前列腺电切术(TURP)治疗中老年重度前列腺增生(BPH)的临床疗效。方法于2018年1月—2020年7月方便选取该院泌尿外科诊治的90例前列腺增生的中老年患者,按术式分为非联合组45例和联合组45例。非联合组采... 详细信息

目的观察经皮膀胱造瘘术后行经尿道前列腺电切术(TURP)治疗中老年重度前列腺增生(BPH)的临床疗效。方法于2018年1月—2020年7月方便选取该院泌尿外科诊治的90例前列腺增生的中老年患者,按术式分为非联合组45例和联合组45例。非联合组采取单一TURP治疗,联合组在TURP术前联合经皮膀胱造瘘术。比较两组手术的临床疗效。结果联合组患者的手术时间和住院时间(101.2±10.2)min、(9.0±1.0)d均比非联合组(121.3±9.6)min、(11.5±1.2)d的患者短,术中出血量(110.2±11.4)mL少于非联合组(154.3±15.4)mL,切除的腺体总体积(7.4±0.6)cm3大于非联合组(6.9±0.8)cm3,差异有统计学意义(t=9.626、10.736、15.440、3.354,P0.05)。结论经皮膀胱造瘘术后行TURP治疗中老年重度BPH患者效果显著,预后良好,值得推广。

关键词：重度前列腺增生经尿道前列腺电切术经皮膀胱造瘘术

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上尿路结石合并糖尿病患者并发尿源性脓毒血症的危险因素

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广东医学 2022年第7期43卷 893-898页

作者：洪旭伟蓝开健池泽湃吴维楚刘国元汕头市中心医院泌尿外科广东汕头515031

目的探讨上尿路结石(upper urinary tract calculi,UUTC)合并糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者并发尿源性脓毒血症的危险因素。方法回顾性分析248例UUTC合并DM患者的临床资料,将患者分为并发尿源性脓毒血症组(研究组,共97例)和未并发... 详细信息

目的探讨上尿路结石(upper urinary tract calculi,UUTC)合并糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者并发尿源性脓毒血症的危险因素。方法回顾性分析248例UUTC合并DM患者的临床资料,将患者分为并发尿源性脓毒血症组(研究组,共97例)和未并发尿源性脓毒血症组(对照组,共151例)。将两组病例资料进行组间比较,应用logistic分析探讨UUTC合并DM患者并发尿源性脓毒血症的危险因素。结果两组在性别、年龄、来诊时症状(包括发热、腰腹疼痛、尿路刺激征)、尿白细胞、尿亚硝酸盐、尿葡萄糖及肾积水程度均差异有统计学意义(P<0.05)。多因素logistic分析发现女性、年龄增长、发热、尿白细胞、尿葡萄糖及重度肾积水可作为UUTC合并DM患者并发尿源性脓毒血症的独立预测因素。结论关注UUTC合并DM患者并发尿源性脓毒血症的危险因素,有助于早期识别高危患者,实施积极有效的干预措施,从而减少并发症,改善患者预后。

关键词：上尿路结石糖尿病尿源性脓毒血症危险因素

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全身免疫炎症指数预测脓毒症病死率:一项回顾性研究

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中华急诊医学杂志 2024年第2期33卷 200-203页

作者：崔业惠李燕王芸飞尚开健山西医科大学太原030000 山西医科大学第二医院急诊科太原030000

脓毒症是由于宿主对感染反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍[1],临床发现,脓毒症患者病情越重其血液学参数异常现象越明显,淋巴细胞减少、中性粒细胞增多、血小板减少最常见[2,3]。此外,这些参数的比值,近几年来也被用作炎性指标,... 详细信息

脓毒症是由于宿主对感染反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍[1],临床发现,脓毒症患者病情越重其血液学参数异常现象越明显,淋巴细胞减少、中性粒细胞增多、血小板减少最常见[2,3]。此外,这些参数的比值,近几年来也被用作炎性指标,并建议作为生物标志物来辅助炎性疾病的诊断及预后的预测。中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)在先前的研究中已被证明是脓毒症可靠的预后指标[4,5]。血小板与淋巴细胞比率(PLR)也是潜在的脓毒症预后指标[6]。单核细胞与淋巴细胞比率(MLR)对脓毒症诊断、预测的可靠性,在先前的研究[7]中还有争议。其他包括3个及以上血液参数比值,如全身免疫炎症指数(SII)是2014年由Hu等[8]首次描述其在肝癌中的预测价值,被认为反映了宿主免疫和炎症条件的平衡。全身炎症反应指数(SIRI)和全身炎症综合指数(AISI)也是两个新型免疫炎症指数,很少有研究对其在脓毒症中的效用进行评估。本研究收集了脓毒症患者入院当天的SII、SIRI、AISI、NLR、PLR和MLR水平。试图比较它们在独立预测脓毒症病死率中的能力,并将其与SOFA评分等其他参数的性能进行了比较。

关键词：淋巴细胞减少器官功能障碍免疫炎症脓毒症患者中性粒细胞增多全身免疫淋巴细胞比率炎性疾病

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不同的尿流改道在尿道下裂手术中的应用

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中国男科学杂志 2016年第11期30卷 34-36页

作者：张源锋张永海徐庆春蓝开健黄洪刘国元陈少川许汉钦广东省汕头市中心医院(中山大学附属汕头医院)泌尿外科汕头515031 广东省惠来人民医院泌尿外科

目的观察不同的尿流改道方法在尿道下裂手术中的应用效果。方法回顾性分析2010年1月至2014年1月的74例尿道下裂患者,采用单纯留置Foley导尿管和U型尿道支架管联合耻骨上膀胱造瘘引流尿液,一期尿道成形。结果 74例患者术后获随访10～4... 详细信息

目的观察不同的尿流改道方法在尿道下裂手术中的应用效果。方法回顾性分析2010年1月至2014年1月的74例尿道下裂患者,采用单纯留置Foley导尿管和U型尿道支架管联合耻骨上膀胱造瘘引流尿液,一期尿道成形。结果 74例患者术后获随访10～46个月,出现膀胱痉挛12例,切口感染4例,尿瘘8例。与单纯留置导尿管的术后膀胱痉挛、切口感染、尿瘘发生率相比较,U型尿道支架管联合耻骨上膀胱造瘘法的并发症发生率明显降低（P〈0.05）。结论尿道支架管联合耻骨上膀胱造瘘是一种有效、可行的尿流改道方法。

关键词：尿道下裂/外科学尿流改道术

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