全长人源抗VEGF抗体库的构建及展示

作     者：蓝开健 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谭万龙;周辰

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肾癌 抗VEGF抗体 全长抗体 人源抗体 抗体筛选 哺乳动物细胞表面展示 

摘      要：肾细胞癌又称肾癌,是成人最常见的肾脏肿瘤,可见于各个年龄段,高发年龄50-70岁。在我国,肾肿瘤在泌尿外科肿瘤中占第二位,仅次于膀胱肿瘤。且肾癌对放疗、化疗效果不明显副作用大。由于其起病隐匿,诊断时有一部分已发生转移。即使是局限性肾癌,采用根治性切除术后仍有近30%患者会复发。因此,全身转移性肾癌及肾癌术后复发的治疗成为泌尿外科研究的重点和难点。 随着研究深入,发现肾癌多存在VHL-HIF-VEGF信号通路。因此,抑制或阻断VHL-HIF-VEGF信号通路,特别是阻断VEGF或其受体VEGFR,就可能抑制肾癌的生长。 贝伐单抗(Bevacizumab)是VEGF特异性抗体,是经过人源化改造的鼠源抗体,与VEGF特异性结合并阻断其生物活性。2007年12月美国FDA批准转移性肾癌的一线治疗方案其中就有贝伐单抗联合IFN-α的靶向治疗。 然而,通过杂交瘤技术获得的鼠源单抗经过人源化改造,不可能完全去除抗体的免疫原性,且抗体空间构型可能发生改变,亲和力往往会降低,在临床上表现为小剂量疗效有限,大剂量或联合用药导致副反应增加的问题。目前常用噬菌体展示技术、核糖体展示技术、酵母菌展示技术在内的常用的人源抗体展示技术,都没有或者有着与哺乳动物细胞不同的蛋白质折叠和转录后修饰功能,所以其所展示的抗体不能形成正确的三级结构,亲和力不高,表达及纯化难度大,且只能筛选到抗体片段(单链抗体可变区片段scFv或者抗原结合片段Fab)而非全长抗体。为了克服以上抗体制作的不足,研究者尝试利用哺乳动物细胞表面抗体展示技术筛选人源抗体。迄今为止,哺乳动物细胞表面展示技术所构建抗体库的库容量多局限于104-106,筛选抗体多样性不足,难以满足筛选高亲和力抗体的要求。 为了克服上述抗体筛选技术存在的不足,本课题组对现有的哺乳动物细胞展示技术作了技术改良。为了提高筛选到特异性抗VEGF抗体的几率,本实验应用来自于肾癌及自身免疫病患者的外周血淋巴细胞(PBMC)为材料构建抗体库。通过提取患者PBMC的总RNA,进行RT-PCR扩增全套抗体基因,随后使用哺乳动物细胞表达载体pDGB-HC-TM,构建了两个全长人源抗体基因库,库容量达到1010以上。为了提高筛选到特异性抗VEGF抗体的成功率,充分利用贝伐单抗的抗VEGF导向选择作用,本课题通过全基因方法合成了贝伐单抗的轻、重链可变区基因,分别与上述构建好的两个全长人源的抗体库配对,通过四片段连接的方法插入双表达载体pDGB4,构建两个二级抗体库。并构建了用于表达贝伐单抗的阳性对照载体pDGB4-avastin。然后将其稳定转染FCHO细胞,成功构建能稳定展示全长抗体的哺乳动物细胞库。利用流式细胞分选技术,我们能从构建的细胞库中筛选到在细胞表面稳定展示能与VEGF抗原结合的抗体的FCHO细胞。通过两轮的富集,可结合VEGF抗原的阳性细胞分别增加20.7倍和7.8倍;随后利用流式细胞分选术进行了单细胞分选,获得了轻链18株、重链8株可结合VEGF抗原的单克隆细胞。为进一步获得全长人源抗VEGF抗体奠定了基础。 一、全长人源初级抗体库的构建及展示 目的： 采用哺乳动物表面展示技术构建全长人源初级抗体库。 方法： 1.外周血淋巴细胞的分离及总RNA的提取 采集患者静脉血,置入抗凝管中,采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞,加入Buffer RLT,裂解细胞,一80℃冰箱保存备用或者直接用于提取总RNA。 ***第一链的合成 以总RNA为模板,根据V-BASE网站信息所设计合成的全套人抗体重链可变区引物和全套人抗体轻链恒定区引物,逆转录合成cDNA第一条链。 3.全套IgG1重链可变区基因和轻链K型全长基因的扩增 以合成的cDNA为模板,用对应的特异性引物扩增全套IgG1轻链κ型全长基因及全套IgGl重链可变区基因(3套轻链引物,3套重链引物)。PCR条件为：94℃预变性5分钟,然后进行35个循环的PCR扩增(94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min),随后在延长温度下反应7min,以确保全长目的片段的合成。 ***扩增产物的分离纯化 用PCR扩增抗体重链可变区基因和全套Kappa轻链。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段。 5.重链抗体基因库及轻链基因库的构建及鉴定 用BsmBI对PCR扩增的重链基因产物及载体pDGB-HC-TM进行酶切,电泳分析并回收目的片段,将回收的载体片段和抗体基因片段用T4DNA连接酶按1：1进行连接,16℃反应24h后,化学转化感受态大肠杆菌TOPO-10,构建重链基因库。 用SfiI酶切轻链全长基因和载体pDGB-HC-TM,电泳回收目的DNA片段,