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一种新的分化心肌细胞筛选策略:稳定表达αMHC-Bla^r-2A-EGFP-Rex-mCherry-2A-neo融合基因的人胚胎干细胞系的建立及其向心肌细胞定向分化的鉴定

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中国生物化学与分子生物学报 2012年第3期28卷 276-282页

作者：魏晋牟晓宁马跃蒋曹德西南大学生命科学学院重庆400715 中国科学院生物物理研究所北京100101 中国科学院研究生院北京100080 西南大学动物科技学院重庆400715

心肌梗死是威胁人类健康的重要疾病之一,胚胎干细胞来源的心肌细胞移植是目前治疗心肌梗死的研究热点.但是由于受到分化的心肌细胞纯度的影响,限制了心肌分化的机理研究以及临床应用.本实验构建含有心肌特异性启动子α-MHC启动的灭瘟素(... 详细信息

心肌梗死是威胁人类健康的重要疾病之一,胚胎干细胞来源的心肌细胞移植是目前治疗心肌梗死的研究热点.但是由于受到分化的心肌细胞纯度的影响,限制了心肌分化的机理研究以及临床应用.本实验构建含有心肌特异性启动子α-MHC启动的灭瘟素(Blasticidin,简称Blar)抗性基因及增强绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒表达载体αMHC-Blar-2A-EGFP-Rex-mCherry-2A-neo.应用慢病毒转染技术将慢病毒转染到人胚胎干细胞(hESCs),胚胎干细胞特异性启动子Rex启动mCherry和neo抗性蛋白的表达.经过G418药物筛选,建立G418和mCherry阳性的细胞系.通过PCR及流式细胞术,进一步鉴定稳定转染的hESCs细胞系;核型分析表明,该细胞系在建立过程中仍保持细胞核型的稳定.在诱导稳定转染的hESCs向心肌细胞分化的实验中,分化的心肌细胞表达心肌细胞特异的肌钙蛋白(cTnT),同时具有EGFP和Blasticidin药物筛选的双标记.本实验建立的这一细胞系可用于心肌细胞的纯化,为深入研究心肌发生发育的关键调控机制及临床应用奠定基础.

关键词：心肌特异性 α肌球蛋白重链启动子慢病毒人胚胎干细胞心肌细胞

Gm4CL2基因对拟南芥和紫花苜蓿耐铝性的影响

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草业学报 2022年第10期31卷 122-134页

作者：林涛张立娇韩蓉蓉玉永雄蒋曹德西南大学动物科学技术学院重庆市草食动物资源保护与利用工程研究中心重庆400715 广安市饲料工业管理站四川广安638000

4CL(4-coumarate:coenzyme A ligase)是木质素合成途径关键酶,已被证明在生物和非生物胁迫、机械损伤抗性等生物过程中具有重要作用,但与柠檬酸分泌相关的耐铝功能还没有报道。本研究选择丹波黑大豆Gm4CL2,利用RT-PCR技术克隆其全长编... 详细信息

4CL(4-coumarate:coenzyme A ligase)是木质素合成途径关键酶,已被证明在生物和非生物胁迫、机械损伤抗性等生物过程中具有重要作用,但与柠檬酸分泌相关的耐铝功能还没有报道。本研究选择丹波黑大豆Gm4CL2,利用RT-PCR技术克隆其全长编码序列,蛋白质序列多重序列比对和进化树分析不同物种间的亲缘关系,农杆菌介导浸花法和叶盘法分别遗传转化拟南芥和紫花苜蓿,qRT-PCR技术检测基因的表达水平。序列分析结果发现,Gm4CL2全长编码序列为1668 bp,该基因编码555个氨基酸,为双子叶植物Ⅰ类4CL。Real-time PCR结果显示,50μmol·L^(-1) AlCl_(3)(pH 4.5)特异诱导Gm4CL2在丹波黑大豆幼苗0~2 cm的根尖组织表达;过表达Gm4CL2拟南芥,在铝处理条件下其根尖AtMATE、AtSTAR1和AtSTAR2表达量显著上调(P<0.05)。Al^(3+)胁迫条件下,过表达Gm4CL2拟南芥根相对伸长量、根尖SOD、POD活性和柠檬酸分泌量显著高于野生型,根尖伊文思蓝和铬天青S染色以及Al^(3+)、ROS、MDA含量显著低于野生型(P<0.05);过表达Gm4CL2紫花苜蓿根相对伸长率、根尖柠檬酸分泌量和生物量显著高于野生型,根尖Al^(3+)含量、伊文思蓝染色显著低于野生型(P<0.05)。细胞壁成分分析表明,Al^(3+)胁迫和非胁迫下,过表达Gm4CL2拟南芥根尖果胶、咖啡酸、阿魏酸比野生型显著降低(P<0.05);Al^(3+)胁迫下,过表达Gm4CL2拟南芥根尖木质素含量显著降低,但是4-香豆酸含量显著升高(P<0.05)。上述结果表明,Gm4CL2为耐铝基因,该基因通过促进细胞壁修饰和柠檬酸分泌提高拟南芥和紫花苜蓿的耐铝性。

关键词： Gm4CL2 耐铝性柠檬酸分泌拟南芥紫花苜蓿

不同添加物和密度对杂交狼尾草青贮效果的影响

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草业科学 2021年第11期38卷 2191-2199页

作者：路桂聪许辉玉永雄蒋曹德西南大学动物科学技术学院重庆400715 四川水利职业技术学院四川成都611231

本研究采用四因素三水平正交设计试验,探讨了玉米粉(A)(0、3%、6%)、尿素(B)(0、0.3%、0.6%)、乳酸菌(C)(0、5、10 g·t^(−1))、密度(D)(700、800、900 kg·m^(−3))对高水分杂交狼尾草(Pennisetum americanum×P.purpureum)青贮品质及营养价值的影响,筛选出最佳的青贮密度以及玉米粉、乳酸菌和尿素添加量,以提高杂交狼尾草的青贮品质。结果显示:(1)6个处理组感官评定综合评分9~15分,等级为二级以上。(2)随着玉米粉剂量的增加,极显著地提高了青贮料粗蛋白(crude protein,CP)含量和相对饲用价值(relative feeding value,RFV)(P尿素>乳酸菌剂,且密度为700 kg·m^(−3)时效果最好。最优配比为6%的玉米粉、0.6%的尿素、5 g·t^(−1)的乳酸菌、700 kg·m^(−3)的密度。

关键词：玉米粉洗涤纤维密度乳酸菌青贮品质营养价值尿素

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山羊PHLDA2启动子克隆和甲基化分析

自然科学 2022年第3期10卷 386-396页

作者：苏鲁方刘小云郑瑜包纯蒋曹德江汉大学生命科学学院湖北武汉西南大学动物科技学院重庆

为了研究山羊血小板白细胞C激酶底物同源性样结构域蛋白家族A成员2 (pleckstrin homology-like domain family A member 2, PHLDA2)基因表达水平与其启动子甲基化状态相关性,试验采用RT-PCR方法检测PHLDA2在各组织间的表达水平(心脏、... 详细信息

为了研究山羊血小板白细胞C激酶底物同源性样结构域蛋白家族A成员2 (pleckstrin homology-like domain family A member 2, PHLDA2)基因表达水平与其启动子甲基化状态相关性,试验采用RT-PCR方法检测PHLDA2在各组织间的表达水平(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪、舌、大脑、胎盘),以及扩增了山羊PHLDA2基因启动子区域序列,并利用Methylation specific PCR技术检测CpG岛在山羊各组织间的甲基化水平。结果表明:克隆得到的山羊PHLDA2 1842 bp的启动子序列与绵羊、牛PHLDA2启动子同源性分别达93.2%和87.9%;启动区CpG岛内第三位点CpG的甲基化频率和胎盘第一外显子区域甲基化水平显著低于其他组织(P <0.05)。说明PHLDA2的mRNA相对表达量水平与启动子区CpG岛(−302~−88 bp)内第三个CpG位点甲基化频率和第一外显子CpG岛(49~333 bp)甲基化水平呈负相关。

关键词：山羊胎盘 PHLDA2 启动子 CpG岛甲基化分析甲基化水平

大足黑山羊PHLDA2基因的克隆、组织表达与印记状况分析

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中国农业科学 2015年第2期48卷 343-351页

作者：苏鲁方彭学强蒋曹德西南大学动物科技学院/重庆市草食动物资源保护与利用工程研究中心西南大学生命科学学院

【目的】克隆大足黑山羊PHLDA2(pleckstrin homology-like domain,family A,member 2)基因序列,分析其组织表达特征、印记状况以及与胎盘性状的关系,为深入研究该基因在山羊胎盘中的功能积累数据。【方法】根据人、牛和猪PHLDA2的保守... 详细信息

【目的】克隆大足黑山羊PHLDA2(pleckstrin homology-like domain,family A,member 2)基因序列,分析其组织表达特征、印记状况以及与胎盘性状的关系,为深入研究该基因在山羊胎盘中的功能积累数据。【方法】根据人、牛和猪PHLDA2的保守区域设计引物以RT-PCR方法扩增大足黑山羊该基因部分c DNA序列,进一步利用5′-和3′-RACE技术获得全长c DNA序列;利用ORF Finder和Prot Param等在线工具分析PHLDA2基因序列特征;采用Real-time PCR方法分析PHLDA2在大足黑山羊心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、脂肪、舌和胎盘等10个组织的表达差异;寻找大足黑山羊和波尔山羊PHLDA2基因序列SNP位点,基于表达SNP的方法分析该基因在F1代组织中的印记状况;采用线性回归的方法分析PHLDA2表达量与胎盘性状的关系。【结果】①克隆得到935 bp大足黑山羊PHLDA2的c DNA全长序列,其中5′-UTR、3′-UTR和编码序列分别为62 bp、450 bp和420 bp,其编码140个氨基酸。②预测的山羊PHLDA2蛋白分子量大小为15 638.7 Da,等电点为9.18,二级结构由α-螺旋(37.14%)、β-转角(9.29%)、延伸链(23.57%)和无规卷曲(30%)组成,并且包含保守的PH(pleckstrin homology)结构域。3BLAST分析发现,山羊PHLDA2定位于29号染色体,其与牛、猪、猕猴、马和人同源基因核苷酸序列的相似性分别达到91%,90%,90%,90%和89%,在核苷酸和氨基酸序列上与牛的亲缘关系最近。4荧光定量PCR结果显示PHLDA2在山羊胎盘中表达量最高(P0.05),在脾中未检测到表达。5印记分析表明,PHLDA2在初生山羊胎盘、心脏和肝脏组织表达母源等位基因,但在肺、大脑和肌肉组织为双等位基因表达。6PHLDA2表达水平与山羊胎盘重回归关系显著(n=15,R2=0.855,P<0.01)。【结论】山羊PHLDA2基因序列和结构特征具有物种间的保守性,但是其印记状况具有组织特异性;PHLDA2为山羊胎盘的生长和功能调控的重要基因。

关键词：山羊 PHLDA2 基因克隆荧光定量PCR 组织表达印记分析

猪IFIT1基因的克隆、生物信息学和组织表达分析

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西南大学学报（自然科学版） 2011年第6期33卷 79-84页

作者：董然然李顺蒋曹德西南大学生命科学学院重庆400715

采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法,对荣昌猪IFIT1基因进行克隆测序,利用生物信息学方法分析其结够和功能,并用Real-ti me PCR方法分析初生个体和1月龄个体11个不同组织(肺、心、肾、舌头、膀胱、卵巢、脾、肝、肌肉、胃和小肠)的表达情况... 详细信息

采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法,对荣昌猪IFIT1基因进行克隆测序,利用生物信息学方法分析其结够和功能,并用Real-ti me PCR方法分析初生个体和1月龄个体11个不同组织(肺、心、肾、舌头、膀胱、卵巢、脾、肝、肌肉、胃和小肠)的表达情况.结果表明:IFIT1基因cDNA序列为1971 bp(GenBank登录号:HQ679904),包含5 UTR48 bp,全部CDS序列1437 bp和3 UTR487 bp,编码478个氨基酸,相对分子质量为55 232.9×103,等电点为6.18.其二级结构以α-螺旋和无归卷曲为主,三级结构具有典型的三角四肽和螺旋转角螺旋重复结构.荧光定量结果显示IFIT1表达量在初生个体和1月龄个体各组织间均存在着显著性差异(p<0.01),初生个体在脾脏中的表达量高于其它各组织(p<0.01),1月龄个体在肌肉中的表达量高于其它组织(p<0.01).

关键词：猪 IFIT1 基因克隆生物信息学组织表达

猪DLK1基因序列特征、印记状况分析和组织表达比较

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猪DLK1基因序列特征、印记状况分析和组织表达比较

利用牛乳腺细胞和小鼠乳腺组织分析异绿原酸C通过NF-κB信号通路对乳腺炎症反应的抑制效应

中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会

作者：杨宗林蒋曹德西南大学

提取了2月龄大白猪、梅山猪及其正反交 F1代个体的 DNA 或 RNA 样品,采用 RT-PCR、 SNP 和相对定量分析的方法研究了猪 DLK1基因的不同剪接体,印记状况和各组织表达的差异。结果表明:猪 DLK1氨基酸具有糖基化位点,表皮生长因子重复结构... 详细信息

提取了2月龄大白猪、梅山猪及其正反交 F1代个体的 DNA 或 RNA 样品,采用 RT-PCR、 SNP 和相对定量分析的方法研究了猪 DLK1基因的不同剪接体,印记状况和各组织表达的差异。结果表明:猪 DLK1氨基酸具有糖基化位点,表皮生长因子重复结构特征和 delta/notch/serrate 信号分子家族高度相关的二级结构,并且与其他哺乳动物的氨基酸序列具有高度同源性;在2月龄猪的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、胃、舌头、小肠、骨骼肌和脂肪组织中除了表达 DLK1-B 和 DLK1-C2外,还发现了新的剪接体 DLK1-A:并且三种剪接体在所检测的组织中均只表达父源的等位基因;DLK1基因总的表达量在各组织中存在显著性差异 (P<0.01),其中骨骼肌和肺表达量最高,其次是舌、脾和脂肪,心脏和肝最低(P<0.05)。因此,DLK1基因在哺乳动物间高度保守;猪在生长发育的各个阶段主要表达 DLK1-C2剪接体, 在某阶段也表达 DLK1-A 或 DLK1-B:DLK1基因在猪生长发育的不同阶段和不同组织中只表达父源等位基因,并且对于猪各个组织生长发育起着必要的作用,但总的表达量在不同生长发育时期组织中存在差异。

关键词：印记基因 DLK1 选择性剪接组织表达猪

来源： cnki会议评论

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畜牧兽医学报 2023年第9期54卷 3931-3940页

作者：陈喜宏路桂聪王浩磊苟少校玉永雄林涛蒋曹德西南大学动物科学技术学院、重庆市食草动物资源保护与利用工程技术研究中心重庆400715 广安市饲料工业管理站广安638000

旨在探究异绿原酸C(ICAC)对乳腺炎及NF-κB炎性通路的抑制作用。本研究以脂多糖(LPS)分别刺激牛乳腺上皮细胞(MAC-T)和小鼠乳腺组织建立体外和体内炎性模型,采用MTT方法筛选ICAC处理MAC-T细胞的适宜浓度,ELISA检测炎性因子(IL-1β、IL-6... 详细信息

旨在探究异绿原酸C(ICAC)对乳腺炎及NF-κB炎性通路的抑制作用。本研究以脂多糖(LPS)分别刺激牛乳腺上皮细胞(MAC-T)和小鼠乳腺组织建立体外和体内炎性模型,采用MTT方法筛选ICAC处理MAC-T细胞的适宜浓度,ELISA检测炎性因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)和炎性介导因子(COX-2和iNOS)的表达水平,Western blot方法检测NF-κB信号通路关键蛋白(IκB和p65)的表达水平和磷酸化水平。结果发现:1)ICAC在20~100 mg·L^(-1)的浓度下对MAC-T细胞没有显著的生长抑制作用(P>0.05);2)1 mg·L^(-1)的LPS处理引起MAC-T细胞中IL-1β、IL-6的蛋白质表达量极显著高于对照组(P<0.01),ICAC处理(20、50、80 mg·L^(-1))极显著下调了MAC-T细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2和iNOS的表达量(P<0.01);3)小鼠腹腔注射的ICAC(60、80、100 mg·kg^(-1))均降低了LPS诱导的CD3的表达,小鼠乳腺组织T淋巴细胞浸润减少;4)ICAC显著降低了LPS诱导的MAC-T细胞和小鼠乳腺组织中p65和IκB的磷酸化水平(P<0.05),抑制了p65的核转移。上述结果说明,异绿原酸C通过NF-κB炎性通路抑制MAC-T细胞和小鼠乳腺组织的炎性反应,但是异绿原酸C在奶牛乳腺炎防治中的应用有待进一步研究。

关键词：异绿原酸C 抗炎作用 NF-κB MAC-T 小鼠乳腺

月桂酸单甘脂的作用机理及对畜禽生产性能影响的研究进展

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中国畜牧杂志 2023年第12期59卷 93-98页

作者：林涛苟少校林燕代发文刘准王合川玉永雄蒋曹德西南大学动物科学技术学院重庆市食草动物资源保护与利用工程技术研究中心重庆400715 广安市饲料管理工作站四川广安638000 四川农业大学动物营养研究所动物抗病营养教育部重点实验室四川雅安625014 乐山师范学院竹类病虫防控与资源开发四川省重点实验室四川乐山641000 四川齐全农牧集团股份有限公司四川遂宁629100 广安鑫农发展有限公司四川广安638000

长期滥用抗生素会导致抗生素在畜禽体内残留以及病原菌产生耐药性等问题,已严重影响畜禽生产及人类健康,迫切需要天然的抗生素替代物。月桂酸单甘酯(GML)具有广谱抗菌、抗病毒、抗炎等多种生物学活性,无毒害残留,可作为抗生素的天然替... 详细信息

长期滥用抗生素会导致抗生素在畜禽体内残留以及病原菌产生耐药性等问题,已严重影响畜禽生产及人类健康,迫切需要天然的抗生素替代物。月桂酸单甘酯(GML)具有广谱抗菌、抗病毒、抗炎等多种生物学活性,无毒害残留,可作为抗生素的天然替代品。本文从GML的作用机理、抗氧化应激、调节免疫炎症反应、改善动物肠道健康等方面阐述GML对动物生长性能、肉质品质、产蛋能力的影响,旨在为GML在畜禽养殖业中的应用和抗生素替代品研究提供新思路。

关键词：月桂酸单甘酯畜禽生产性能肠道健康