大足黑山羊PHLDA2基因的克隆、组织表达与印记状况分析

作     者：苏鲁方 彭学强 蒋曹德 SU Lu-fang;PENG Xue-qiang;JIANG Cao-de

作者机构：西南大学动物科技学院/重庆市草食动物资源保护与利用工程研究中心 西南大学生命科学学院 

出 版 物：《中国农业科学》 (Scientia Agricultura Sinica)

年 卷 期：2015年第48卷第2期

页      面：343-351页

核心收录：

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

基　　金：重庆市科委自然科学基金项目(CSTC,2009BA-1052) 中央高校基本科研业务费专项(XDJK2011C022) 

主　　题：山羊 PHLDA2 基因克隆 荧光定量PCR 组织表达 印记分析 

摘      要：【目的】克隆大足黑山羊PHLDA2(pleckstrin homology-like domain,family A,member 2)基因序列,分析其组织表达特征、印记状况以及与胎盘性状的关系,为深入研究该基因在山羊胎盘中的功能积累数据。【方法】根据人、牛和猪PHLDA2的保守区域设计引物以RT-PCR方法扩增大足黑山羊该基因部分c DNA序列,进一步利用5′-和3′-RACE技术获得全长c DNA序列;利用ORF Finder和Prot Param等在线工具分析PHLDA2基因序列特征;采用Real-time PCR方法分析PHLDA2在大足黑山羊心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、脂肪、舌和胎盘等10个组织的表达差异;寻找大足黑山羊和波尔山羊PHLDA2基因序列SNP位点,基于表达SNP的方法分析该基因在F1代组织中的印记状况;采用线性回归的方法分析PHLDA2表达量与胎盘性状的关系。【结果】①克隆得到935 bp大足黑山羊PHLDA2的c DNA全长序列,其中5′-UTR、3′-UTR和编码序列分别为62 bp、450 bp和420 bp,其编码140个氨基酸。②预测的山羊PHLDA2蛋白分子量大小为15 638.7 Da,等电点为9.18,二级结构由α-螺旋(37.14%)、β-转角(9.29%)、延伸链(23.57%)和无规卷曲(30%)组成,并且包含保守的PH(pleckstrin homology)结构域。3BLAST分析发现,山羊PHLDA2定位于29号染色体,其与牛、猪、猕猴、马和人同源基因核苷酸序列的相似性分别达到91%,90%,90%,90%和89%,在核苷酸和氨基酸序列上与牛的亲缘关系最近。4荧光定量PCR结果显示PHLDA2在山羊胎盘中表达量最高(P0.05),在脾中未检测到表达。5印记分析表明,PHLDA2在初生山羊胎盘、心脏和肝脏组织表达母源等位基因,但在肺、大脑和肌肉组织为双等位基因表达。6PHLDA2表达水平与山羊胎盘重回归关系显著(n=15,R2=0.855,P0.01)。【结论】山羊PHLDA2基因序列和结构特征具有物种间的保守性,但是其印记状况具有组织特异性;PHLDA2为山羊胎盘的生长和功能调控的重要基因。