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静注人免疫球蛋白分离纯化工艺研究

静注人免疫球蛋白分离纯化工艺研究

作者：范加金山东大学

学位级别：硕士

静注人免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin,IVIG）是用单采血浆技术采集大量健康献血者的血浆混合通过不同分离纯化方法制备而成,其主要成分为IgG。临床上主要用于原发性、继发性免疫球蛋白缺陷和自身免疫性疾病（如原发性血小板... 详细信息

静注人免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin,IVIG）是用单采血浆技术采集大量健康献血者的血浆混合通过不同分离纯化方法制备而成,其主要成分为IgG。临床上主要用于原发性、继发性免疫球蛋白缺陷和自身免疫性疾病（如原发性血小板减少性紫癜、川崎病等）。随着人们对血液制品认识的深入,IVIG治疗的适应症不断增加,用IVIG治疗慢性脱髓鞘多发性神经炎症、类风湿关节炎以及视网膜相关疾病都获得批准。国内现已经批准上市的IVIG产品均采用传统的低温乙醇工艺,该工艺生产周期长,需要低温环境操作,能源消耗大。产品质量与国外相比也有一定差距,该工艺的局限性仍然会伴有不同程度的副作用发生,例如IVIG中残留的杂蛋白IgA导致IgA缺乏者的过敏反应和添加的糖类稳定剂导致肾功能衰竭等临床副作用。尽管产品的安全性得到不断提高,但大部分仅采用了一种机制的病毒灭活方法。因此,针对国内IVIG产品生产工艺相对落后、产品质量和安全性也有待进一步提升的现状,本论文开展了IVIG第四代辛酸-层析工艺的研究,以生产出高纯度、更安全、更有效的静注人免疫球蛋白产品。经过实验室研究,确定了辛酸-层析工艺IVIG原液制备路线:将融化后的合并血浆在低温条件下加入乙醇,压滤分离出F Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀。将F Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ溶解,采用辛酸沉淀杂蛋白进行初步纯化,压滤去除沉淀,留取上清。将上清液调整pH值和电导率后,进行第一次阴离子交换层析,去除制品中白蛋白及部分IgA等杂质,收集流穿液。再调整流穿液pH值和电导率后,进行第二次阴离子交换层析,去除大分子杂质蛋白,收集流穿液,获得高纯IgG。将第二次层析后的流穿液调整pH后进行超滤浓缩、脱盐。根据蛋白质含量,加入适量甘氨酸进行配制,调整样品至pH 3.4～4.4,置24±1℃孵放21天灭活病毒。孵放结束后,采用20纳米膜过滤,截留去除分子尺寸大于膜孔径的各类病毒分子,避免或去除病毒污染的可能性。根据确定的工艺路线,在GMP车间进行中试放大,连续试制三批产品。三批制品依据注册标准全检合格。对三批中试产品进行长期和加速稳定性研究,现已完成6个月加速试验和12个月长期稳定性试验,检测指标全部合格。将本研究的辛酸-层析工艺IVIG、法国LFB公司已上市辛酸-层析工艺IVIG和公司已上市低温乙醇工艺IVIG产品各项质量指标的全检结果进行对比研究,上述三种产品各项质量指标检测结果相近,对比性研究结果证明本研究的辛酸-层析工艺与LFB公司及我公司低温乙醇工艺IVIG产品物质基础一致且质量特征等同。并且IgA和FXI/FXIa质量指标优于公司低温乙醇工艺产品,发生副反应的风险更低,安全性更高。

关键词：静注人免疫球蛋白制备工艺纯化病毒灭活

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HER2阳性乳腺癌重组免疫毒素的开发

中国现代应用药学 2023年第7期40卷 881-887页

作者：彭延杰张林吴正理范加金仲立军曹强庚山东省妇幼保健院济南250014 西南大学重庆400715

目的制备一种人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)阳性乳腺癌的高活力重组免疫毒素TP25。方法利用基因工程技术将曲妥珠单抗可变区与绿脓杆菌细胞毒素片段进行重组,经原核表达获得具有完整结构的高活... 详细信息

目的制备一种人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)阳性乳腺癌的高活力重组免疫毒素TP25。方法利用基因工程技术将曲妥珠单抗可变区与绿脓杆菌细胞毒素片段进行重组,经原核表达获得具有完整结构的高活性融合蛋白TP25,采用免疫荧光法与流式细胞技术检测TP25与不同乳腺癌细胞系的结合能力,通过3H-Thymidin掺入法检测其对肿瘤细胞的杀伤活力,通过测定单链DNA的产生研究TP25诱发肿瘤细胞发生凋亡。结果经酶切与PCR验证成功构建融合蛋白TP25重组表达质粒,经原核包涵体表达制备出分子量为52 kDa的TP25制品,经验证TP25能与HER2高表达的乳腺癌细胞结合,具有活性空间构象,细胞增殖试验显示TP25的细胞毒性强弱与用量呈正相关,能引发HER2阳性乳腺癌细胞发生凋亡。结论制备了HER2阳性乳腺癌靶向免疫毒素TP25。

关键词：人表皮生长因子受体2 乳腺癌免疫毒素原核表达细胞增殖凋亡

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维生素K_2的生理作用及其在纳豆中的研究进展

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黑龙江医药 2016年第3期29卷 395-399页

作者：范加金彭延杰严为留山东省生物制品研究所山东泰邦生物制品有限公司江南大学

维生素K_2(Menaguinone,MK)是一种脂溶性维生素,具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的系列衍生物,共有14种同系物,是人体中不可缺少的重要维生素之一。MK主要由肠道细菌以及芽孢杆菌合成,同时存在于传统食品纳豆中。MK可以促进凝血酶原与磷... 详细信息

维生素K_2(Menaguinone,MK)是一种脂溶性维生素,具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的系列衍生物,共有14种同系物,是人体中不可缺少的重要维生素之一。MK主要由肠道细菌以及芽孢杆菌合成,同时存在于传统食品纳豆中。MK可以促进凝血酶原与磷酸脂质体结合而发生凝血过程,同时还可以直接参与骨骼代谢,因此在医药方面有重要作用。本文主要分析了MK在凝血与骨骼代谢方面的生理作用及其在微生物体内的生物合成途径,并对纳豆菌(芽孢杆菌)合成维生素K_2进行了综述。

关键词：维生素K2 凝血骨骼代谢纳豆菌

我国血液制品生产监管法律法规历史沿革及发展建议

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食品与药品 2017年第6期19卷 457-462页

作者：王燕波孙钟毓李杰范加金臧恒昌山东大学药学院山东济南250012 山东泰邦生物制品有限公司山东泰安271000

血液制品全过程监管是政府监管血液制品安全有效的重要措施。在我国,监管的整体框架已基本建立且日趋合理,但法律法规在科学管理和技术指导等方面仍需进一步完善。本文通过文献研究和专业人士访谈,梳理了血液制品全过程监管的法律法规,... 详细信息

血液制品全过程监管是政府监管血液制品安全有效的重要措施。在我国,监管的整体框架已基本建立且日趋合理,但法律法规在科学管理和技术指导等方面仍需进一步完善。本文通过文献研究和专业人士访谈,梳理了血液制品全过程监管的法律法规,概括行业现状,对现阶段政府全过程监管血液制品进行积极有益的探究,并对完善我国血液制品监督管理提出改进建议。

关键词：血液制品法律法规现状建议

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人血白蛋白低温乙醇工艺中脂蛋白的残留分析

中国输血杂志 2014年第10期27卷 1025-1027页

作者：范加金杨列清冯卫国林锋菅长永井金荣山东泰邦生物制品有限公司山东泰安271000 山东省生物制品研究所

目的分析本公司用低温乙醇工艺从合格原料血浆到人血白蛋白成品分离过程中脂蛋白的残留量。方法使用日立7600-ISE(2P)全自动生化分析仪,分别对原料血浆、分离过程、纯化过程以及人血白蛋白成品留样检测。结果所检测的几种脂蛋白经过组分... 详细信息

目的分析本公司用低温乙醇工艺从合格原料血浆到人血白蛋白成品分离过程中脂蛋白的残留量。方法使用日立7600-ISE(2P)全自动生化分析仪,分别对原料血浆、分离过程、纯化过程以及人血白蛋白成品留样检测。结果所检测的几种脂蛋白经过组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ、组分Ⅳ分离过程基本被去除,经进一步纯化后制品中脂蛋白残留量为零。结论本公司生产的人血白蛋白成品未检测出残留脂蛋白。

关键词：低温乙醇工艺脂蛋白残留

首批重组人血白蛋白蛋白质含量RS2国家标准品的研制

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中国药学杂志 2022年第15期57卷 1283-1286页

作者：王敏力王弢李炎邵泓李镭范加金马力李宝泉罗清徐苗侯继锋中国食品药品检定研究院 WHO生物制品标准化和评价合作中心卫生部生物技术产品检定方法及标准化重点实验室北京100050 兰州生物制品研究所有限责任公司兰州730046 四川省食品药品检验检测院成都611731 上海市食品药品检验研究院上海201203 浙江博锐生物制药有限公司浙江台州318000 山东泰邦生物制品有限公司山东泰安271000 华兰生物工程股份有限公司河南新乡453003 信达生物制药(苏州)有限公司江苏苏州215123 三生国健药业(上海)股份有限公司上海201203

目的研制一种重组人血白蛋白蛋白质含量RS2国家标准品,用于重组人血白蛋白等产品的蛋白质含量测定。方法选取重组人血白蛋白产品作为原料,经质量浓度9 g·LNaCl溶液稀释后除菌过滤分装。在8家实验室按经确认和验证的方法进行协作标定并... 详细信息

目的研制一种重组人血白蛋白蛋白质含量RS2国家标准品,用于重组人血白蛋白等产品的蛋白质含量测定。方法选取重组人血白蛋白产品作为原料,经质量浓度9 g·LNaCl溶液稀释后除菌过滤分装。在8家实验室按经确认和验证的方法进行协作标定并开展稳定性监测。结果8家实验室采用包括高效液相色谱法(HPLC)、福林酚法(Lowry)、紫外测定法(UV)、2,2′-联喹啉-4,4′-二羧酸法(BCA)等测定本批标准品,蛋白质含量实验室间均值为1961(Min 1904,Max 2063)μg·mL^(-1),95%置信区间(1917,2016)μg·mL^(-1);实验室间标定结果均值标准差52.89,标准误18.70,相对标准偏差(RSD)为2.70%。2~8℃持续对该标准品进行稳定性监测19个月,蛋白质含量未发生趋势性变化,建议本品按2~8℃保存和运输。结论重组人血白蛋白蛋白质含量RS2国家标准品符合相关规定,可以发放用于重组人血白蛋白相关的质量控制。

关键词：重组人血白蛋白蛋白质含量测定国家标准品重组生物药物

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破伤风人免疫球蛋白纳米膜过滤工艺验证

破伤风人免疫球蛋白纳米膜过滤工艺验证

山东和广西地区献浆者的血浆白蛋白和IgG相对含量的初步分析

中国输血协会第十届输血大会

作者：井金荣张为松曹大伟石干杨列清李斌范加金山东泰邦生物制品有限公司

目的验证纳米膜过滤在破伤风人免疫球蛋白生产中的应用。方法经低温乙醇分离工艺制备低pH孵放后的中间品,采用20nm纳米膜进行过滤,调整pH、二次超滤、除菌分装的实验品,与相对应批次正常生产的成品进行纯度、分子大小分布等关键质量指...

目的验证纳米膜过滤在破伤风人免疫球蛋白生产中的应用。方法经低温乙醇分离工艺制备低pH孵放后的中间品,采用20nm纳米膜进行过滤,调整pH、二次超滤、除菌分装的实验品,与相对应批次正常生产的成品进行纯度、分子大小分布等关键质量指标的对比研究;评估纳米膜过滤效率。结果纳米膜过滤对产品外观有一定的改善作用,产品的纯度、分子大小分布、热稳定性等指标与正常产品无明显差异;纳米膜过滤前后蛋白质回收率大于95%,与此同时纳米膜过滤拥有较好的过滤效率,适用于规模化生产。

关键词：

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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国际生物制品学杂志 2016年第1期39卷 20-25页

作者：冯卫国杨列清范加金杨虎虎山东泰邦生物制品有限公司生产部泰安271000 山东生物制品研究所泰安271000

目的分析山东和广西地区献浆者的血浆白蛋白和IgG含量的差异，以提高血浆利用率。方法将3600份血浆样品按地区、性别、年龄段（18~29、30~40和41～55岁）进行分组，每组100份样品。用AU5400型全自动生化分析仪检测血浆总蛋白、白蛋白和... 详细信息

目的分析山东和广西地区献浆者的血浆白蛋白和IgG含量的差异，以提高血浆利用率。方法将3600份血浆样品按地区、性别、年龄段（18~29、30~40和41～55岁）进行分组，每组100份样品。用AU5400型全自动生化分析仪检测血浆总蛋白、白蛋白和IgG含量，并用单因素方差分析对检测结果进行统计分析。结果单因素方差分析显示，山东与广西地区献浆者间的白蛋白／IgG比值差异具有统计学意义：18～29、30和40和41-55岁男性献浆者F值分别为138．994、186．262和139．056，P值均为0．000；18-29、30-40和41-55岁女性献浆者F值分别为209．670、174．120和155．081，P值均为0．000。山东与广西地区献浆者间的IgG含量差异具有统计学意义：18-29、30-40和41～55岁男性献浆者F值分别为146．756、186．262和195．263，P值均为0．000；18-29、30-40和41～55岁女性献浆者F值分别为186．133、190．365和206．300，P值均为0．000。结论山东和广西地区献浆者的血浆白蛋白和IgG含量存在差异。

关键词：血浆血清白蛋白免疫球蛋白G 差异

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人凝血酶原复合物临床应用研究进展

临床血液学杂志（输血与检验） 2014年第2期27卷 352-355页

作者：郑志华菅长永张翠萍张惠范加金臧恒昌山东大学药学院济南250012 山东泰邦生物制品有限公司

凝血酶原复合物（PCC）的制备工艺目前国内外基本相同，都是以新鲜冰冻血浆（FFP）为起始原料，经DEAEA-50凝胶批式吸附（1次或者2次），超滤配制，冷冻干燥，并在制备过程中采用有机溶剂／去污剂（Solvent／Detergent，S／D）灭活脂包... 详细信息

凝血酶原复合物（PCC）的制备工艺目前国内外基本相同，都是以新鲜冰冻血浆（FFP）为起始原料，经DEAEA-50凝胶批式吸附（1次或者2次），超滤配制，冷冻干燥，并在制备过程中采用有机溶剂／去污剂（Solvent／Detergent，S／D）灭活脂包膜病毒（如HIV等），

关键词：凝血酶原复合物肝病口服抗凝逆转血栓