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猪丁型冠状病毒NSP14蛋白截短表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立

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南方农业学报 2024年第4期55卷 1238-1248页

作者：刘思雨何颖卢冰霞赵武赵硕许心婷全琛宇秦毅斌欧阳康广西大学动物科学技术学院/广西高校动物疫病预防与控制重点实验室/广西兽用生物制品工程研究中心广西南宁530004 广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室/农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室广西南宁530001

【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDC... 详细信息

【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDCoV 1468B毒株为模板,构建NSP14截短基因原核重组质粒pET32a-NSP14,经双酶切和测序鉴定后,通过原核表达系统获得NSP14融合蛋白,将其纯化后免疫新西兰大白兔获得NSP14蛋白的多克隆抗体,进行Western blotting验证,并用间接ELISA测定其效价。以NSP14融合蛋白为抗原包被酶标板,采用方阵滴定法优化一系列反应条件,构建检测PDCoV抗体的间接ELISA。【结果】在构建的pET32a-NSP14重组质粒中,NSP14蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,其大小约40.2 kD;制备的NSP14蛋白多克隆抗体效价在1∶512000以上,经Western blotting验证,能与纯化的NSP14融合蛋白发生特异性反应。经过筛选,确定所构建检测PDCoV抗体间接ELISA的最佳反应条件:NSP14融合蛋白最佳包被浓度为4.0μg/mL,包被条件为37℃、2.0 h;封闭条件为5%脱脂奶粉封闭1.0 h;待检血清按1∶400稀释,孵育2.0 h;酶标二抗1∶2500稀释,孵育60.0 min;TMB底物显色时间为30.0 min。特异性试验结果表明,猪病阳性血清PRRSV、JEV、PCV2、PPV、PEDV和CSFV的OD450均小于0.235,说明优化的间接ELISA检测的病原与其他猪病毒阳性血清无反应,特异性良好。重复性试验结果表明,优化的间接ELISA检测猪病阳性血清的批内和批间变异系数均小于10.000%,说明优化的ELISA具有较好的重复性。【结论】成功制备具有高效价和良好免疫反应性的PDCoV NSP14蛋白多克隆抗体,并建立检测该抗体的特异性、敏感性和重复性良好的间接ELISA,可供进一步研究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断参考应用。

关键词：猪丁型冠状病毒 NSP14蛋白原核表达多克隆抗体制备间接ELISA

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猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用

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动物医学进展 2024年第2期45卷 11-16页

作者：周颖赵硕覃国喜梁龙华肖婷陈忠伟卢冰霞秦毅斌林昌华张胜斌段群棚胡庭俊何颖广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 广西壮族自治区兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室/农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室广西南宁530001 广西农垦永新畜牧集团金光公司广西南宁530042 广西农垦永新畜牧集团西江公司广西贵港537100

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感... 详细信息

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10^(3)~10^(4)倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。

关键词：猪肺炎支原体猪鼻支原体 TaqMan荧光定量PCR

猪德尔塔冠状病毒N蛋白单克隆抗体2D7的制备与生物学特性鉴定

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中国动物传染病学报 2022年

作者：张宁赵平刘思雨赵硕陈忠伟何颖欧阳康卢冰霞蒋家霞郭旋林昌华赵武黄伟坚秦毅斌赵凌广西职业技术学院广西桂垦牧业有限公司广西大学动物科学技术学院广西壮族自治区兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室/农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室广西农垦永新畜牧集团西江有限公司广西农垦永新畜牧集团金光有限公司

为获得猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody，McAb)，本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因，构建表达质粒，转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌，诱导表达后获得PDCoV-N... 详细信息

为获得猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody，McAb)，本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因，构建表达质粒，转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌，诱导表达后获得PDCoV-N重组蛋白，将其进行纯化后再免疫小鼠，制备针对PDCoV-N蛋白的McAb，并进行了抗体的效价测定、免疫荧光(IFA)、Western blotting、亚类的鉴定、McAb特异性的鉴定。结果，成功构建pCold II-PDCoV-N重组原核表达质粒，SDS-PAGE显示重组N蛋白成功表达，分子质量约为38 kDa；经小鼠免疫、细胞融合、亚克隆筛选获得一株分泌PDCoV-N蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞株；制备的腹水经间接ELISA方法测定抗体的效价为2.048×10。IFA、Western blotting试验表明该McAb可以与PDCoV-N蛋白及全病毒特异性结合，亚类鉴定其亚型为IgG1，轻链为κ链。该McAb只与PDCoV反应，而与其它猪肠道病毒无交叉反应，表明本研究制备的McAb具有良好的特异性。本研究成功制备了PDCoV-N蛋白的McAb，为进一步研究PDCoV的生物学特性和诊断试剂的开发提供技术支持。

关键词：猪德尔塔冠状病毒 N蛋白单克隆抗体

ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

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中国兽医科学 2023年第6期53卷 671-678页

作者：赵硕陈忠伟肖婷何颖张宁覃国喜卢冰霞段振华秦毅斌张胜斌段群棚赵武韦明宇广西壮族自治区兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室广西南宁530001 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070 广西农垦永新畜牧集团金光有限公司广西南宁530042 玉林市动物疫病预防控制中心广西玉林537000 广西农垦永新畜牧集团西江有限公司广西贵港537100 广西农垦永新畜牧集团有限公司广西南宁530022

为了建立一种可同时精准、快捷鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,本研究选择猪源β-actin为内参基因,根据ASFV的P72基因及PRRSV的ORF6基因设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了ASFV和PR... 详细信息

为了建立一种可同时精准、快捷鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,本研究选择猪源β-actin为内参基因,根据ASFV的P72基因及PRRSV的ORF6基因设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证,并初步应用于临床样品的检测。结果显示,该方法可在45 min内完成对ASFV、PRRSV及猪源β-actin基因的特异性扩增;对ASFV、PRRSV及猪源β-actin标准品模板的最低检测拷贝数分别为7.87×101 copies/μL、1.19×102 copies/μL和5.99×103 copies/μL,同一模板的3次重复试验的组内及组间变异系数均小于2%;用该方法检测92份临床样品,未检出ASFV,检出19份PRRSV阳性样品。结果表明,本研究建立了一种可快速鉴别检测ASFV及PRRSV的多重荧光定量PCR方法,较普通PCR敏感性高103倍,可应用于ASFV和PRRSV的快速鉴别诊断及流行病学调查。

关键词：非洲猪瘟病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒多重TaqMan荧光定量PCR

猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

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中国兽医科学 2022年第11期52卷 1373-1378页

作者：秦秋英速雪丽黄诗婷秦毅斌何颖卢冰霞陈樱韦祖樟黄伟坚欧阳康广西大学动物科学技术学院动物传染病与分子免疫学实验室广西南宁530005 广西壮族自治区兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室广西南宁530005

针对猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的N基因建立检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,并验证了其特异性、敏感性和重复性等。结果显示,本方法特异性高,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪肠病毒、伪狂犬病病毒、猪... 详细信息

针对猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的N基因建立检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,并验证了其特异性、敏感性和重复性等。结果显示,本方法特异性高,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪肠病毒、伪狂犬病病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪星状病毒等病原无交叉反应。本方法C_(t)值与标准模板浓度在10^(8.5)~10^(3.5)PFU/mL范围内呈良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9949,直线方程为y=-3.5949x+41.006,最低检测限为10^(2.50)PFU/mL。运用该方法检测PDCoV感染不同来源细胞系的病毒载量,发现的PDCoV感染宿主谱广,能感染不同来源的细胞,且在LLC-PK细胞上的复制能力最强。本研究建立的方法为PDCoV的防控提供了技术支持。

关键词：猪德尔塔冠状病毒 N基因荧光定量PCR LLC-PK细胞

猪德尔塔冠状病毒CHN/20GXNN-1/2020分离鉴定及遗传进化分析

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动物医学进展 2023年第1期44卷 12-18页

作者：速雪丽秦毅斌陆颖杜琛赵武何颖陈樱韦祖樟黄伟坚欧阳康广西大学动物科学技术学院/广西高校动物疫病预防与控制重点实验室广西南宁530005 广西壮族自治区兽医研究所广西南宁530005 广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心广西南宁530005 广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室广西南宁530005

为了解广西地区猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的流行特点,对该地区PDCoV进行分离鉴定及遗传进化分析。将20份检测为PDCoV阳性的样品接种于LLC-PK细胞,经RT-PCR及IFA鉴定,获得1株PDCoV,命名为CHN/20GXNN-1/2020。通过TCID50和RT-qPCR测定,该... 详细信息

为了解广西地区猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的流行特点,对该地区PDCoV进行分离鉴定及遗传进化分析。将20份检测为PDCoV阳性的样品接种于LLC-PK细胞,经RT-PCR及IFA鉴定,获得1株PDCoV,命名为CHN/20GXNN-1/2020。通过TCID50和RT-qPCR测定,该毒株的病毒滴度及病毒载量在连续传代过程中逐步增高。其S基因核苷酸在153 bp-155 bp位置存在3 bp的缺失,氨基酸有23个位点发生突变。S基因同源性分析结果表明,PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020与中国多数流行毒株的亲缘关系更近。结果表明,分离鉴定出1株新的PDCoV毒株,为冠状病毒生物学特性研究提供了材料,也为进一步开展病毒致病性研究及疫苗研制奠定了基础。

关键词：猪德尔塔冠状病毒分离鉴定 S基因遗传进化分析