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MST1和LATS1在牦牛黄体形成、维持和退化中的表达及HCG对其表达的影响

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农业生物技术学报 2024年第8期32卷 1844-1856页

作者：周应聪张同享王靖雷赵凌张瑞姚颖钱文洁崔燕余四九樊江峰阿拉善左旗动物疫病预防控制中心甘肃农业大学动物医学院甘肃农业大学甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心

哺乳动物STe20样激酶1 (mammalian STE20-like kinase 1, MST1)和大肿瘤抑制蛋白1 (large tumor suppressor kinase 1, LATS1)是Hippo通路核心激酶级联反应链的关键成员，参与雌性动物生殖过程并发挥重要作用。为探究MST1和LATS1与牦牛(... 详细信息

哺乳动物STe20样激酶1 (mammalian STE20-like kinase 1, MST1)和大肿瘤抑制蛋白1 (large tumor suppressor kinase 1, LATS1)是Hippo通路核心激酶级联反应链的关键成员，参与雌性动物生殖过程并发挥重要作用。为探究MST1和LATS1与牦牛(Bos grunniens)黄体(corpus luteum, CL)形成、维持和退化之间的关系。本研究采集雌性牦牛黄体组织，按照黄体形成(红体期和有腔黄体期)、维持(妊娠黄体期)和退化(退化黄体期)的不同阶段将材料分为4组，通过qPCR和Western blot检测MST1和LATS1 mRNA及蛋白在黄体形成、维持和退化中的表达差异性，运用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)对MST1和LATS1在黄体形成、维持和退化中进行定位分析。另外，分离培养牦牛卵巢颗粒细胞(granule cells,GC)，通过添加人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)诱导颗粒细胞黄体化，采用qPCR、Western blot和免疫荧光(immunofluorescence, IF)等方法对MST1和LATS1 m RNA及蛋白在颗粒细胞黄体化前后进行定量和定位分析。结果显示，MST1和LATS1 mRNA及蛋白在牦牛黄体不同发育阶段表达量存在差异，在妊娠黄体期MST1表达量最高，而LATS1在有腔黄体期的表达最为丰富，在退化黄体期MST1和LATS1表达量均最低。IHC结果显示，在牦牛粒性黄体细胞中MST1和LATS1分布广泛，且MST1在血管内皮细胞中特征表达。添加5 IU/mL HCG诱导颗粒细胞黄体化后，MST1和LATS1 m RNA及蛋白的表达量极显著上升。通过IF染色发现，MST1和LATS1蛋白主要定位于颗粒细胞细胞质，且黄体化前后位置没有改变。研究结果表明，MST1和LATS1介导Hippo信号通路通过控制颗粒细胞分化，黄体细胞增殖和凋亡，参与雌性牦牛黄体组织的形成、维持、退化以及功能运转，并且与黄体生理过程中各类生殖激素密切相关。本研究为进一步探索Hippo信号通路对牦牛黄体组织大小调控以及调节哺乳动物生殖生理过程的作用机制提供了基础资料。

关键词：牦牛黄体哺乳动物STe20样激酶1 (MST1) 大肿瘤抑制蛋白1 (LATS1) Hippo通路 HCG

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奶牛乳源外泌体提取方法的优化及效果评价

动物营养学报 2024年第2期36卷 1265-1276页

作者：赵莹王靖雷王萌王立斌张倩李志杰马鑫余四九潘阳阳甘肃农业大学动物医学院兰州730070 甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心兰州730070

乳源外泌体在疾病治疗及载体效应等领域应用颇为广泛,但目前乳源外泌体的提取方法仍步骤繁琐,耗时长,难以推广应用。为建立省时、高效和稳定的乳源外泌体提取方法,本试验在前期已建立的差速超速离心法、凝乳酶法、乙酸法及蔗糖密度梯度... 详细信息

乳源外泌体在疾病治疗及载体效应等领域应用颇为广泛,但目前乳源外泌体的提取方法仍步骤繁琐,耗时长,难以推广应用。为建立省时、高效和稳定的乳源外泌体提取方法,本试验在前期已建立的差速超速离心法、凝乳酶法、乙酸法及蔗糖密度梯度离心法的基础上,通过增加离心速度、改变乙酸或凝乳酶用量、调整蔗糖密度梯度、减少离心步骤进行逐一优化。通过透射电子显微镜、纳米粒子跟踪分析、蛋白浓度检测、免疫印迹鉴定比较乳源外泌体形态结构、粒径大小、蛋白浓度、粒子浓度、特异性标记蛋白的差异,筛选出最优提取方法。结果显示:4种优化后提取方法均可分离获得具有典型“茶托”形状,介于30~200 nm的细胞外囊泡,但优化后的乙酸法提取乳源外泌体最多,视野密度高达80%以上,粒径大小为(151.0±47.2)nm,粒子浓度为6.2×10^(12)个/mL,均高于其他优化方法;优化后的乙酸法提取乳源外泌体的特异性标记蛋白[肿瘤易感基因101(TSG101)、热休克蛋白70(HSP70)、CD81和CD9]均表达量较高,其他3种优化方法提取到的乳源外泌体特异性标记蛋白发生不同程度降解,且提取乳源外泌体所得样品蛋白浓度均显著高于优化的乙酸法(P<0.05)。结果表明,优化后奶牛乳源外泌体乙酸提取法具有方法简单、耗时短、纯度高、特异性标记蛋白稳定等优点,该方法为外泌体需求量大的试验、医疗、工业生产等奠定一定基础。

关键词：乳源外泌体差速超速离心法乙酸凝乳酶提取鉴定

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牦牛RBM3的基因克隆及其在不同繁殖时期卵巢、输卵管、子宫中的表达定位

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畜牧兽医学报 2022年第7期53卷 2202-2214页

作者：张晖潘阳阳王靖雷张瑞黄嘉馨余四九崔燕甘肃农业大学动物医学院兰州730070

旨在研究RBM3在牦牛(Bos grunniens)生殖相关调控中的作用。本研究以卵泡期、黄体期和妊娠期4~6岁健康雌性牦牛各3头为采集对象,采集其卵巢、子宫和输卵管共9组试验样品,每组设置3个生物学重复。利用基因克隆技术克隆牦牛RBM3基因并进... 详细信息

旨在研究RBM3在牦牛(Bos grunniens)生殖相关调控中的作用。本研究以卵泡期、黄体期和妊娠期4~6岁健康雌性牦牛各3头为采集对象,采集其卵巢、子宫和输卵管共9组试验样品,每组设置3个生物学重复。利用基因克隆技术克隆牦牛RBM3基因并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot,WB)分别在基因层面和蛋白层面检测RBM3在牦牛子宫、卵巢和输卵管中的相对表达量;利用免疫组织化学(immunocytochemistry,IHC)方法检测RBM3蛋白在试验样品中的分布定位。牦牛RBM3基因(GenBank No.:MF142258.1)被成功克隆并预测出二、三级结构,发现其与野牦牛亲缘性最近,基因编码区第51位、98位核苷酸不同于常见哺乳动物,生物信息学分析预测其编码的蛋白质为稳定的非跨膜蛋白。RBM3蛋白在本试验9组样品的表达量有如下差异:在卵巢中,黄体期显著高于卵泡期和妊娠期(P<0.05);输卵管中,卵泡期显著低于黄体期和妊娠期(P<0.05);子宫上,卵泡期显著高于黄体期和妊娠期(P<0.05)。免疫组织化学结果显示,RBM3在卵巢中的主要表达位置是卵泡膜、颗粒层和黄体细胞;在输卵管的表达位置是黏膜上皮;子宫上的表达主要以子宫内膜和子宫腺为主。本研究结果提示,RBM3可能参与牦牛个体发情周期和妊娠过程的调控以及妊娠识别等过程,为RBM3这一冷应激调节因子参与牦牛对高原环境的适应性生理机制方面的研究提供参考。

关键词：牦牛生殖调控 RNA结合基序蛋白3 冷应激

牦牛TGF-β1基因克隆及在雌性生殖系统主要器官中的表达定位

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生物技术通报 2022年第6期38卷 279-290页

作者：王楠张瑞潘阳阳何翃宏王靖雷崔燕余四九甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心兰州730070

转化生长因子β1(transforming growth factor beta1,TGF-β1)是一种多功能的生长与分化因子,广泛调控机体的多个生理病理过程,具有重要的生物学功能和广阔的应用前景。试验采集牦牛发情期和妊娠期卵巢、输卵管和子宫组织,克隆牦牛TGF-... 详细信息

转化生长因子β1(transforming growth factor beta1,TGF-β1)是一种多功能的生长与分化因子,广泛调控机体的多个生理病理过程,具有重要的生物学功能和广阔的应用前景。试验采集牦牛发情期和妊娠期卵巢、输卵管和子宫组织,克隆牦牛TGF-β1基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)、蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)等方法,对牦牛TGF-β1在基因和蛋白水平上进行定量分析。结果显示,牦牛TGF-β1基因(GenBank ***004937)高度保守,牦牛TGF-β1核苷酸序列与普通牛(Bos taurus)序列相比,存在差异,所编码氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸。与普通牛(Bos taurus)、瘤牛×普通牛(Bos indicus×Bos taurus)亲缘关系最近,与犬(Canine)亲缘关系最远,其编码的蛋白为稳定的亲水性膜蛋白。牦牛TGF-β1在卵泡期、黄体期、妊娠期的卵巢、输卵管和子宫组织中均有表达,在卵巢中,妊娠期的表达量显著高于卵泡期和黄体期(P<0.05);在输卵管中,TGF-β1基因妊娠期表达量极显著高于卵泡期和黄体期(P<0.01);在子宫中,卵泡期和妊娠期表达显著高于黄体期(P<0.05)。IHC结果显示,牦牛TGF-β1主要在卵巢生殖上皮、卵泡膜、卵泡颗粒层、黄体细胞、输卵管黏膜上皮细胞、子宫腺(UG)和子宫内膜细胞中表达。研究结果为进一步探索TGF-β1参与牦牛生殖生理的分子机制提供基础数据,以期为探讨高原哺乳动物对高寒环境的适应性提供理论依据。

关键词：牦牛 TGF-β1 基因克隆生物信息学分析表达

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E-cadherin在牦牛不同繁殖周期输卵管不同部位中的表达与定位

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核农学报 2022年第1期36卷 57-65页

作者：杨珊珊何翃闳刘敏清赵凌王靖雷余四九蔡得琪潘阳阳甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心甘肃兰州730070 甘肃省金昌市金川区农业农村局甘肃金昌737100

为研究上皮钙粘蛋白(E-cadherin)在不同繁殖周期牦牛输卵管不同部位中的表达差异,本研究采集卵泡期、黄体期和妊娠期无临床病理表现的母牦牛(3~6岁)输卵管伞部、壶腹部和峡部的样品,将不同繁殖周期输卵管分别按照伞部、壶腹部和峡部分为... 详细信息

为研究上皮钙粘蛋白(E-cadherin)在不同繁殖周期牦牛输卵管不同部位中的表达差异,本研究采集卵泡期、黄体期和妊娠期无临床病理表现的母牦牛(3~6岁)输卵管伞部、壶腹部和峡部的样品,将不同繁殖周期输卵管分别按照伞部、壶腹部和峡部分为9组,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(western-blotting)检测E-cadherin基因和蛋白在不同时期牦牛输卵管不同部位中的表达情况,运用免疫组织化学法检测E-cadherin在不同时期牦牛输卵管不同部位中的定位。结果显示,在卵泡期,E-cadherin基因和蛋白在输卵管壶腹部的表达量最高,显著高于伞部和峡部;在黄体期,E-cadherin基因和蛋白在输卵管峡部的表达量最高,显著高于伞部和壶腹部;在妊娠期,E-cadherin基因在输卵管壶腹部的表达量最高,显著高于伞部和峡部,而E-cadherin蛋白在输卵管壶腹部的表达量最高,显著高于伞部。在输卵管伞部,E-cadherin基因在黄体期的表达量最高,显著高于卵泡期和妊娠期,而E-cadherin蛋白在卵泡期的表达量最高,显著高于黄体期和妊娠期;在输卵管壶腹部,E-cadherin基因和蛋白在妊娠期的表达量最高,显著高于卵泡期和黄体期;在输卵管峡部,E-cadherin基因和蛋白在黄体期的表达量最高,显著高于卵泡期和妊娠期。免疫组织化学结果显示,E-cadherin主要分布于输卵管伞部、壶腹部和峡部的纤毛细胞、分泌细胞、基细胞、肌层和浆液腺等部位。E-cadherin在牦牛繁殖周期输卵管不同部位中的均有表达,且其基因和蛋白的表达存在显著差异,说明E-cadherin可能参与了牦牛卵母细胞的生长和成熟、精子储存和获能、受精及早期胚胎发育等一系列生殖过程。本研究为进一步明确E-cadherin对牦牛繁殖性能的生物学作用提供了基础资料。

关键词：上皮钙粘蛋白牦牛输卵管繁殖周期表达

抑制素A对牦牛颗粒细胞FSH、LH及其受体表达的影响

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核农学报 2023年第1期37卷 51-59页

作者：王立斌王军乾赵凌黄振华王萌王靖雷余四九潘阳阳甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心甘肃兰州730070

为了探明抑制素A(INHA)对牦牛卵泡颗粒细胞中促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)与其受体结合发挥的作用,通过体外培养牦牛卵泡颗粒细胞,采用免疫荧光技术(IF)检测促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LHR)在颗粒细胞中的分布情况,用不同浓度外... 详细信息

为了探明抑制素A(INHA)对牦牛卵泡颗粒细胞中促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)与其受体结合发挥的作用,通过体外培养牦牛卵泡颗粒细胞,采用免疫荧光技术(IF)检测促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LHR)在颗粒细胞中的分布情况,用不同浓度外源性INHA(0、1.25、2.5、5、10、20 ng·mL^(-1))作用12 h后,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测颗粒细胞中FSHβ、LHβ、FSHR、LHR基因的表达情况,采用酶联免疫分析试验(ELISA)检测细胞内外FSH、LH的含量。结果显示,FSHR和LHR在颗粒细胞质与细胞核中均有表达。FSHβ和LHβ基因在颗粒细胞中的表达随INHA浓度的增大呈先降后升的趋势;INHA浓度接近5 ng·mL^(-1)时,FSHβ表达最低;INHA浓度接近10 ng·mL^(-1)时,LHβ表达最低;FSHR和LHR基因的表达与INHA浓度呈负相关。INHA浓度接近5 ng·mL^(-1)时,颗粒细胞内外FSH含量最低;INHA浓度接近10 ng·mL^(-1)时,颗粒细胞内外LH含量最低;其他INHA浓度下,当颗粒细胞内容物中FSH和LH含量降低时,细胞上清中含量升高。综上所述,INHA对FSHR和LHR基因在颗粒细胞中的表达存在明显的抑制作用,并且影响FSHβ和LHβ基因在颗粒细胞中的表达。研究表明INHA可以抑制牦牛卵泡颗粒细胞中FSH、LH与其受体的结合;同时,INHA对颗粒细胞内外FSH和LH的含量具有重要调节作用。本研究为进一步探索抑制素对雌性牦牛生殖调控的影响提供了理论依据。

关键词：颗粒细胞抑制素A(INHA) 促卵泡素(FSH) 促黄体素(LH) 受体

牦牛早期胚胎核旁斑点形成及对后续发育的影响

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中国农业科学 2023年第6期56卷 1189-1203页

作者：潘阳阳王靖雷王萌王立斌张倩陈睿张甜甜崔燕徐庚全樊江峰余四九甘肃农业大学动物医学院甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心

【目的】明确牦牛早期胚胎发育过程中核旁斑点形成的关键时期，确定其参与形成长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNAs)，探索核旁斑点形成对后续胚胎发育能力的影响及调控机制。【方法】体外受精生产牦牛胚胎，DAPI染色标记结合核... 详细信息

【目的】明确牦牛早期胚胎发育过程中核旁斑点形成的关键时期，确定其参与形成长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNAs)，探索核旁斑点形成对后续胚胎发育能力的影响及调控机制。【方法】体外受精生产牦牛胚胎，DAPI染色标记结合核旁斑点结构蛋白1(paraspeckle Protein 1,PSPC1)mRNA实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测确定牦牛早期胚胎发育核旁斑点形成关键时期，免疫荧光技术验证胚胎PSPC1蛋白表达水平；qRT-PCR检测核旁斑点形成相关LncRNAs核旁斑点组装转录因子1(encoding nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1)、共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1(coactivator associated arginine methyltransferase 1,CARM1)及54 kD核结合蛋白（non-POU domain containing octamer-binding protein,p54nrb）mRNA在各时期胚胎中表达水平；RNA干扰技术抑制合子PSPC1 mRNA水平，比较后续各阶段胚胎发育率，通过分析囊胚细胞总数、滋养层细胞数（trophoblast cells,TE）、内细胞团数（inner cell mass,ICM）评估囊胚质量；检测对照组和PSPC1 mRNA干扰组囊胚中B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因（B-celllymphoma/leukemia-2,Bcl-2）和B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x(B-cell lymphoma/leukemia associatedx protein,Bax)表达水平。【结果】（1）在不同发育阶段胚胎细胞的细胞核均可观察到核旁斑点，但2-细胞和4-细胞时期胚胎细胞核中核旁斑点更为清晰，2-细胞至桑椹胚阶段PSPC1 mRNA呈现高水平表达，其中4-细胞到桑椹胚阶段PSPC1 mRNA水平最高，PSPC1蛋白荧光强度在此阶段最强。（2）NEAT1、CARM1及p54nrb mRNA均在2-细胞到桑椹胚阶段呈现高水平表达，其中NEAT1和p54nrb在4细胞时期水平最高，CARM1在2-细胞到桑椹胚3个阶段表达水平差异不显著（P>0.05）。（3）PSPC1 mRNA干扰组桑椹胚与囊胚发育率均显著降低，且桑椹胚发育率降低幅度高于囊胚，PSPC1 mRNA干扰组囊胚细胞总数显著低于对照组，其中以ICM细胞数降低为主，TE细胞数在两组之间差异不显著。（4）PSPC1 mRNA干扰处理组囊胚中促细胞凋亡因子Bax mRNA和蛋白均显著增加，抑凋亡相关因子Bcl-2 mRNA和蛋白降低，且囊胚中内细胞团发生裂解。【结论】牦牛早期胚胎发育核旁斑点形成的关键时期为2-细胞至桑椹胚阶段，其中主要集中在4-细胞时期，且PSPC1、NEAT1、CRAM1、p54nrb在核旁斑点形成时期呈高水平表达。干扰牦牛合子PSPC1 mRNA导致后续胚胎发育能力降低，并通过诱导ICM凋亡降低囊胚质量，影响囊胚中细胞命运决定。

关键词：牦牛核旁斑点细胞命运细胞凋亡长链非编码RNA(LncRNAs)

牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用

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畜牧兽医学报 2023年第6期54卷 2436-2447页

作者：焦正兴潘阳阳王萌王靖雷马文斌高翔张晖崔燕余四九王立斌甘肃农业大学动物医学院兰州730070 甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心兰州730070

旨在克隆牦牛微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)基因,制备牦牛LC3B多克隆抗体,为探究自噬在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础。本研究通过基因克隆方法获得牦牛LC 3B基因序列,利用原核表达... 详细信息

旨在克隆牦牛微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)基因,制备牦牛LC3B多克隆抗体,为探究自噬在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础。本研究通过基因克隆方法获得牦牛LC 3B基因序列,利用原核表达、亲和层析法纯化牦牛LC3B重组蛋白,使用纯化的蛋白为抗原免疫10月龄日本大耳白兔,Sepharose4B柱层析法纯化制备牦牛LC3B多克隆抗体,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体效价,并使用蛋白质免疫印迹(WB)、免疫组织化学法(IHC)和免疫荧光技术(IF)检测牦牛生殖器官中LC3B蛋白的表达。结果显示,本研究成功克隆了牦牛LC 3B基因(登录号:OP572227),构建的重组质粒pET-32a-LC3B能够诱导产生重组蛋白,并且在包涵体和上清中均有表达;所纯化的牦牛LC3B重组蛋白大小为34 ku(含Trx和His标签),符合预期结果。通过免疫日本大耳兔后得到的兔抗牦牛LC3B蛋白血清,抗体效价分别为1∶640000和1∶320000,特异性良好,表明牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备成功。纯化后的抗体应用于牦牛生殖器官中LC3B的表达检测,LC3B在牦牛卵巢、输卵管和子宫中表达,并且能识别LC3B-Ⅰ和发生脂化后的LC3B-Ⅱ,主要表达于细胞质及细胞核周。本研究通过成功克隆牦牛LC 3B基因制备了牦牛LC3B多克隆抗体,使用抗体检测发现LC3B蛋白在牦牛生殖器官中均有表达,表明所制备的多克隆抗体特异性良好,能够应用于牦牛LC3B蛋白的检测和细胞自噬水平的研究。

关键词：牦牛 LC3B 原核表达多克隆抗体生殖

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牦牛ATG5多克隆抗体的制备及应用

中国兽医学报 2023年第10期43卷 2093-2100页

作者：高翔潘阳阳王萌焦正兴王靖雷马文斌王军乾余四九崔燕王立斌甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心甘肃兰州730070

为了进一步研究自噬在牦牛生殖活动中发挥的作用,本研究通过合成牦牛自噬相关5(autophagy related 5,ATG5)基因,并将合成的基因插入pET-32a质粒,转化BL21(DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-Thiogalactoside,IPTG... 详细信息

为了进一步研究自噬在牦牛生殖活动中发挥的作用,本研究通过合成牦牛自噬相关5(autophagy related 5,ATG5)基因,并将合成的基因插入pET-32a质粒,转化BL21(DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-Thiogalactoside,IPTG)诱导表达ATG5重组蛋白并纯化,免疫日本大耳白兔,制备牦牛ATG5多克隆抗体。采用间接ELISA法检测抗体的效价,蛋白质印迹(Western blot,WB)技术检测多克隆抗体的特异性。通过Western blot、免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)和免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)应用所制备的抗体检测ATG5蛋白在牦牛生殖器官中的表达。结果成功构建了pET-32a-ATG5原核表达质粒,转化大肠杆菌IPTG诱导获得了大小约为53 kDa(含His和Trx标签)的重组蛋白;制备的牦牛ATG5多克隆抗体效价为1∶1280000,特异性良好。应用显示,ATG5蛋白在牦牛睾丸和输卵管中均有表达。本研究成功制备了牦牛ATG5多克隆抗体,特异性良好,可用于检测牦牛ATG5蛋白的表达,为进一步研究自噬在牦牛生殖生理活动中发挥的作用积累了材料。

关键词：牦牛 ATG5 原核表达多克隆抗体自噬

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