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基于纳米抗体和石墨烯/金复合材料的免疫传感器检测日本血吸虫循环抗原的研究

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寄生虫与医学昆虫学报 2017年第2期24卷 70-78页

作者：付益修孔庆明郑斌楼涤丁建祖赵沛王淼陆绍红浙江省医学科学院杭州310012 浙江大学杭州310012

将抗日本血吸虫SEA纳米抗体固定于镀金的石墨烯薄膜上,制备一种新型的阻抗型免疫传感器检测日本血吸虫循环抗原。使用扫描电镜、原子力显微镜和拉曼光谱对石墨烯薄膜及石墨烯/金复合材料进行了表征,并对制备的免疫传感器的特异性和灵敏... 详细信息

将抗日本血吸虫SEA纳米抗体固定于镀金的石墨烯薄膜上,制备一种新型的阻抗型免疫传感器检测日本血吸虫循环抗原。使用扫描电镜、原子力显微镜和拉曼光谱对石墨烯薄膜及石墨烯/金复合材料进行了表征,并对制备的免疫传感器的特异性和灵敏度进行了测试。结果显示,所制备的免疫传感器具有较好的特异性和灵敏度,与曼氏裂头蚴、刚地弓形虫、颚口线虫、简单异尖线虫、华支睾吸虫和卫氏并殖吸虫抗原没有交叉反应,检测日本血吸虫可溶性虫卵抗原达到0.01 ng/m L水平;血吸虫病患者血清的阳性检出率为66.7%,优于现有试剂盒ELISA法56.7%的检出率,与ELISA的符合率为90%。该免疫传感器检测日本血吸虫循环抗原具有较高的灵敏度和特异性,制作方法简便、快速等优点,具有较好的应用潜能。

关键词：纳米抗体石墨烯日本血吸虫循环抗原免疫传感器

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抗日本血吸虫SEA纳米抗体制备与分析

寄生虫与医学昆虫学报 2016年第4期23卷 198-204页

作者：郑斌陈睿楼涤丁建祖孔庆明童群波付益修陆绍红浙江省医学科学院寄生虫病研究所杭州310013

利用制备的日本血吸虫虫卵抗原（SEA），免疫健康双峰驼Bactrian camel，分离其外周血淋巴细胞提取总RNA，利用RT—PCR扩增骆驼重链抗体IgG可变区（VHH）基因片段，将VHH片段与载体pMECS连接后电转入大肠杆菌TG1构建纳米抗体文库。经亲... 详细信息

利用制备的日本血吸虫虫卵抗原（SEA），免疫健康双峰驼Bactrian camel，分离其外周血淋巴细胞提取总RNA，利用RT—PCR扩增骆驼重链抗体IgG可变区（VHH）基因片段，将VHH片段与载体pMECS连接后电转入大肠杆菌TG1构建纳米抗体文库。经亲和筛选、phage—ELISA以及测序分析后，挑取阳性克隆，抽提质粒，电转入大肠杆菌WK6诱导表达纳米抗体。通过间接ELISA分析纳米抗体VHH-1的敏感性和特异性。结果显示，纳米抗体文库容量为2．3×10^8，测序分析显示，所获得的纳米抗体文库具有良好的多态性。经NI—NTA和AKTA纯化后获得高纯度纳米抗体。ELISA分析表明所获得的纳米抗体VHH-1具有较好的敏感性和特异性。为进一步开展纳米抗体在日本血吸虫诊治研究中的应用奠定一定基础。

关键词：日本血吸虫虫卵抗原纳米抗体酶联免疫吸附实验

基于日本血吸虫SEA纳米抗体的胶体金免疫层析技术的初步研究

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基于日本血吸虫SEA纳米抗体的胶体金免疫层析技术的初步研究

重组弓形虫棒状体蛋白5诱导小鼠的免疫应答及其抗弓形虫感染的保护作用

第十一届全国寄生虫学青年工作者学术研讨会

作者：丁豪杰丁建祖孔庆明郑斌楼涤陈睿陆绍红浙江省医学科学院寄生虫病研究所

目的:建立基于纳米抗体的检测日本血吸虫感染的胶体金免疫层析技术。方法:将已经通过噬菌体文库筛选得到的两株纳米抗体的质粒,在枯草芽孢杆菌中表达,得到具有活性的抗体蛋白(VHH-48、VHH-52)并以NI-NTA亲合层析纯化。以柠檬酸三钠还原... 详细信息

目的:建立基于纳米抗体的检测日本血吸虫感染的胶体金免疫层析技术。方法:将已经通过噬菌体文库筛选得到的两株纳米抗体的质粒,在枯草芽孢杆菌中表达,得到具有活性的抗体蛋白(VHH-48、VHH-52)并以NI-NTA亲合层析纯化。以柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,标记VHH-48和VHH-52抗体蛋白并制备金标垫,分别用日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)和羊抗鼠Ig G作为检测线和质控线,确定抗体蛋白的最佳标记p H和最适蛋白浓度。采用抗体双夹心的方法对两株抗体蛋白进行组合,建立胶体金免疫层析方法。以优化的双夹心抗体组合,组装试纸条,进行了灵敏度的测定和血吸虫病人粪检阳性血清的敏感性评估,以并殖吸虫等其他寄生虫感染的血清测定了试纸条的特异性。结果:显示表达并获得了纯度较高的纳米抗体。胶体金标记VHH-48和VHH-52抗体的最适蛋白量为14μg/m L和10μg/m L,最适p H分别需要加入16μL和12μL体积的0.2 M K2CO3,并确定以VHH-52标金和VHH52划线为最佳的抗体双夹心组合。对可溶性虫卵抗原的最低检测量为3.4 ng/m L,检测血吸虫病人阳性血清的检出率为2.27%,检测其他寄生虫感染血清结果显示出良好的特异性。结论:成功构建了基于抗日本血吸虫虫卵抗原纳米抗体的胶体金免疫层析试纸条方法,为纳米抗体在血吸虫病快速诊断的应用奠定了一定基础。

关键词：日本血吸虫虫卵抗原纳米抗体胶体金免疫层析方法

来源： cnki会议评论

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寄生虫与医学昆虫学报 2012年第3期19卷 129-135页

作者：郑斌陆绍红童群波孔庆明楼涤浙江省医学科学院寄生虫病研究所杭州310013

为探讨重组弓形虫棒状体蛋白5诱导的免疫应答及其免疫保护效应，本研究克隆表达了弓形虫棒状体蛋白5，并分析其诱导的细胞免疫、体液免疫应答和抗弓形虫感染的保护作用。采用PCR方法从刚地弓形虫cDNA中扩增出ROP5基因片段，将该基因片... 详细信息

为探讨重组弓形虫棒状体蛋白5诱导的免疫应答及其免疫保护效应，本研究克隆表达了弓形虫棒状体蛋白5，并分析其诱导的细胞免疫、体液免疫应答和抗弓形虫感染的保护作用。采用PCR方法从刚地弓形虫cDNA中扩增出ROP5基因片段，将该基因片段克隆至pET-28a原核表达载体表达，用重组ROP5蛋白免疫BALB／c小鼠，ELISA检测免疫后小鼠抗体和细胞因子的变化。以强毒型RH株弓形虫攻击感染免疫小鼠，统计小鼠不同时间存活率，评价重组蛋白产生的免疫保护性。结果表明ROP5重组蛋白疫苗免疫BALB／c小鼠诱导机体产生高水平的IgG、IgG1、IgG2a抗体和IFN—y、IL-2及IL-10细胞因子。与PBS及佐剂对照组相比，重组蛋白免疫组小鼠的存活时间明显延长。本实验证实了ROP5重组蛋白免疫BALB／c小鼠能够诱导其产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答，以及一定的抗弓形虫感染保护作用。

关键词：刚地弓形虫棒状体蛋白5 免疫保护性疫苗

弓形虫抗血清 IgG 的制备及其检测效果研究

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热带病与寄生虫学 2004年第1期2卷 22-24页

作者：楼涤陈睿张乐陆绍红林爱芬卓敏敏傅翠娥浙江省医学科学院寄生虫病研究所杭州310013

目的比较弓形虫不同免疫原所制备抗血清 IgG 的检测效果,优选高效价的抗体诊断试剂。方法制备弓形虫的细胞质抗原(C)、代谢抗原(S)。用抗原 C、C+S、S 及活虫(P)各免疫2只家兔,收集抗血清经纯化而获得 IgG 抗体(多抗)并制备酶标记抗体;... 详细信息

目的比较弓形虫不同免疫原所制备抗血清 IgG 的检测效果,优选高效价的抗体诊断试剂。方法制备弓形虫的细胞质抗原(C)、代谢抗原(S)。用抗原 C、C+S、S 及活虫(P)各免疫2只家兔,收集抗血清经纯化而获得 IgG 抗体(多抗)并制备酶标记抗体;用上述4种多抗与对应的多抗-HRP 组合成4种双抗体夹心型 ELISA,检测人血清 CAg 和 C、S 抗原,评价试剂的敏感性;抗血清与疟原虫、隐孢子虫等抗原进行交叉反应性试验,评价试剂的特异性;采用捕获法检测人血清 IgM 抗体,比较4种多抗-HRP 的检测效果。结果各种 ELISA 夹心法同步检测 CAg 阳性标本7例,阴性样本8例,均未出现假阴性和假阳性反应,其 OD 均值的 P/N 比值依次为 C+C 组33.5、S+S 组27.8、CS+CS 组21.2、P+P 组13.2;C 和 S 抗原的最低检出量均为0.5μg/ml;与其它寄生虫未出现交叉反应。4种多抗-HRP 同步检测IgM 抗体阳性标本3例,阴性样本7例,均未出现假阴性和假阳性反应,其 OD 均值的 P/N 值最高的是抗 C-HRP。结论 4种抗体用于检测人血清 IgM 抗体、CAg、C 和 S 抗原以及其它抗原的结果表明,各种抗体试剂均具有良好的敏感性和特异性,其中以抗 C 抗体试剂最为满意。(2)4种组合形式的夹心ELISA,检测弓形虫抗原的差异无统计学意义,表明弓形虫 C 和 S 抗原间存在着共同抗原成分。

关键词：血清IgG 制备效果研究双抗体夹心型ELISA ELISA夹心法 IgM抗体夹心ELISA 假阳性反应抗体诊断试剂检测效果阳性标本同步检测酶标记抗体 IgG抗体血清CAg 交叉反应性最低检出量弓形虫抗原 S抗原隐孢子虫 P/N值

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直接PCR法检测血液中伊氏锥虫感染

寄生虫与医学昆虫学报 2006年第4期13卷 204-207页

作者：陆绍红陈睿楼涤张乐张雪娟浙江省医学科学院寄生虫病研究所杭州310013 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所杭州310021

为建立伊氏锥虫动基体DNA(KinetoplastDNA,kDNA)的PCR扩增技术,血液直接PCR法检测伊氏锥虫的感染,本文以伊氏锥虫kDNA片段为靶扩增DNA设计引物,确定最适PCR反应条件,建立kDNA片段的PCR扩增技术,应用直接扩增缓冲液(Ampdirect)从感染小... 详细信息

为建立伊氏锥虫动基体DNA(KinetoplastDNA,kDNA)的PCR扩增技术,血液直接PCR法检测伊氏锥虫的感染,本文以伊氏锥虫kDNA片段为靶扩增DNA设计引物,确定最适PCR反应条件,建立kDNA片段的PCR扩增技术,应用直接扩增缓冲液(Ampdirect)从感染小鼠的滤纸血标本直接PCR检测伊氏锥虫。结果发现,PCR扩增伊氏锥虫kDNA片段分子量为364bp,能检测的最小DNA量是0·06pg,与布氏锥虫、活动锥虫没有交叉反应。应用直接扩增缓冲液不需进行样本的DNA抽提,直接PCR能检测感染小鼠的早期滤纸血样本,敏感性高于镜检法。本实验建立的直接PCR法检测伊氏锥虫具有较高的敏感性和特异性,方法快捷,可进一步应用于伊氏锥虫病的早期诊断以及现场调查。

关键词：伊氏锥虫直接PCR 动基体DNA(kDNA) 血液

建立浙江省基层卫生适宜技术推广应用人才信息库的体会

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中华医学科研管理杂志 2013年第6期26卷 403-404页

作者：蒋海瑛陈睿楼涤王美蓉蒋健敏温馨夏志俊浙江省医学科学院杭州310013 浙江省疾病预防控制中心浙江省医学科技教育发展中心

目的掌握基层卫生适宜技术推广应用现有人才的质量和分布量，为适宜技术的可持续性发展提供人才支撑和保障。方法使用ASP和SQLServer技术建立人才信息库，人工录入各单位推荐的优秀人员。结果浙江省8个地市87名基层卫生适宜技术推广应... 详细信息

目的掌握基层卫生适宜技术推广应用现有人才的质量和分布量，为适宜技术的可持续性发展提供人才支撑和保障。方法使用ASP和SQLServer技术建立人才信息库，人工录入各单位推荐的优秀人员。结果浙江省8个地市87名基层卫生适宜技术推广应用优秀人员首批进入人才库，其中管理人员32名（36．78％），应用人员30名（34．48％），研究人员25名（28．74％）；平均年龄为43岁（26～60岁）；平均参与推广时间为3年（1～8年），平均参与推广技术数量为4项（1～13项）。结论人才信息库的建立实现了“一人一档”、动态管理的目标，为卫生适宜技术推广应用人才的挖掘、培养和发展营造条件。

关键词：适宜技术推广应用人才信息库

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青蒿琥酯抗小鼠血吸虫性肝纤维化的作用

中国药理学通报 2019年第6期35卷 854-858页

作者：孔庆明戴方伟丁豪杰郑清四卢领群卓洵辉楼琦楼涤郑斌丁建祖褚晓峰陆绍红浙江省医学科学院寄生虫病研究所浙江省实验动物中心浙江杭州310013 桂林南药股份有限公司广西桂林541004 浙江省实验动物公共服务平台浙江杭州310013

目的研究青蒿琥酯(artesunate,ART)体内抗血吸虫性肝纤维化的作用,探讨其分子机制。方法小鼠经腹部贴片感染血吸虫尾蚴建立肝纤维化动物模型,16周开始每天给予ART灌胃治疗,连续8周。停药4周后,通过定量PCR与Western blot,检测小鼠肝组... 详细信息

目的研究青蒿琥酯(artesunate,ART)体内抗血吸虫性肝纤维化的作用,探讨其分子机制。方法小鼠经腹部贴片感染血吸虫尾蚴建立肝纤维化动物模型,16周开始每天给予ART灌胃治疗,连续8周。停药4周后,通过定量PCR与Western blot,检测小鼠肝组织内纤维化形成相关基因与CHI3L1/ERK信号通路基因的表达水平。结果成功建立了血吸虫性肝纤维化小鼠模型。病理学指标评分显示,ART治疗血吸虫性小鼠肝纤维化有效。给药后,小鼠肝脏基质金属蛋白酶抑制因子TIMP-1和Ⅲ型胶原蛋白Col3α1基因表达水平明显降低,壳多糖酶3样蛋白CHI3L1和ERK1/2基因表达量的降低也具有统计学意义,ERK磷酸化水平被明显抑制。结论 ART在体内对血吸虫性肝纤维化具有明显的抑制作用,其机制可能与抑制胶原蛋白合成及CHI3L1/ERK信号通路的传导有关。

关键词：青蒿琥酯血吸虫肝纤维化壳多糖酶3样蛋白1 胶原蛋白细胞外调节蛋白激酶

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单克隆抗体检测循环血吸虫抗原的实验研究

浙江医学 1992年第3期14卷 1-3页

作者：郑志国陈彩华杨旭明杨纪顺詹丽君傅翠娥楼涤余毅浙江省医学科学院寄生虫病研究所

将血吸虫成虫多糖抗原的单克隆抗体应用于ELISA直接法检测血清中的循环抗原.重感染兔血清35份、中感染兔血清7份及低感染兔血清10份,阳性率分别为100%,57.1%及20%,健康兔血清25份,弓形虫感染兔血清10份,均未见阳性反应.重感染兔于感染后... 详细信息

将血吸虫成虫多糖抗原的单克隆抗体应用于ELISA直接法检测血清中的循环抗原.重感染兔血清35份、中感染兔血清7份及低感染兔血清10份,阳性率分别为100%,57.1%及20%,健康兔血清25份,弓形虫感染兔血清10份,均未见阳性反应.重感染兔于感染后5周OD均值明显上升,是感染前的2.95倍,以后逐周上升.中感染兔5周后,OD均值开始上升,5周和6周时的OD均值是感染前的1.27倍和3.49倍.低感染兔OD均值一直维持较低水平,至9周时OD均值才是感染前的2.56倍.结果表明,血吸虫病兔血清中的循环抗原出现时间或阳性率均与血吸虫尾蚴的感染度密切相关.

关键词：血吸虫病循环抗原单克隆抗体