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布鲁氏菌入侵相关基因IalB缺失株的构建及生物学特性分析

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微生物学报 2023年第3期63卷 1254-1268页

作者：陈蕾张广冻李俊玫秦佩佩李彬刁梓洋周栋靳亚平王爱华西北农林科技大学动物医学院、农业农村部动物生物技术重点实验室陕西杨凌712100

入侵相关基因(invasion-associated locus B,ialB)的同源基因在布鲁氏菌所属的根瘤菌目中是广泛保守的,但其在布鲁氏菌中的功能研究几乎为空白。根据有限的报道资料,猜测ialB的功能可能与布鲁氏菌入侵细胞以及适应胞内环境胁迫有关。【... 详细信息

入侵相关基因(invasion-associated locus B,ialB)的同源基因在布鲁氏菌所属的根瘤菌目中是广泛保守的,但其在布鲁氏菌中的功能研究几乎为空白。根据有限的报道资料,猜测ialB的功能可能与布鲁氏菌入侵细胞以及适应胞内环境胁迫有关。【目的】探究ialB在布鲁氏菌中的生物学功能,揭示其在布鲁氏菌黏附和入侵细胞以及胞内存活中的作用。【方法】以猪种布鲁氏菌S2株为亲本,运用同源重组的方法构建布鲁氏菌ialB缺失株ΔialB,并通过表达质粒转化的方法构建其回补株CΔialB,比较3种菌株的生长特性、对体外应激的敏感性;通过扫描电镜观察ialB缺失对布鲁氏菌形态的影响,通过实时荧光定量PCR检测3种菌株极性延长相关基因的表达;通过免疫荧光和平板计数的方法分析ialB缺失对布鲁氏菌黏附、入侵RAW264.7细胞以及胞内存活的影响。【结果】成功构建了菌株ΔialB和CΔialB;ΔialB与布鲁氏菌S2株相比,生长受限,活力降低,在酸应激、高渗应激、低渗应激、多黏菌素B应激条件下存活率降低,在氧化应激条件下存活率上升;而且,ΔialB的菌体形态发生改变,菌体变短,直径增加,极性延长相关基因mRNA水平的表达下调;此外,ialB缺失不影响布鲁氏菌黏附、入侵RAW264.7细胞的能力,但显著降低了布鲁氏菌胞内存活能力。【结论】入侵相关基因ialB在布鲁氏菌中具有调节细胞活性和菌体正常生长的功能,对布鲁氏菌抵抗外界环境刺激和在宿主细胞内的增殖具有重要作用。

关键词：布鲁氏菌入侵相关基因ialB 基因缺失 RAW264.7细胞生物学特性

野黄芩苷对人舌鳞癌Tca8113细胞细胞周期及Fas/FasL介导的细胞凋亡的影响

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野黄芩苷对人舌鳞癌Tca8113细胞细胞周期及Fas/FasL介导的细胞凋...

作者：李俊玫承德医学院

学位级别：硕士

舌鳞癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一，发病率占口腔癌的39.95%，恶性程度较高，生长快，易发生早期淋巴结转移。目前临床多采用以手术治疗为主，放、化疗为辅的综合治疗方法，但术后复发率及转移率均较高，因此寻求新的治疗途径及有... 详细信息

舌鳞癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一，发病率占口腔癌的39.95%，恶性程度较高，生长快，易发生早期淋巴结转移。目前临床多采用以手术治疗为主，放、化疗为辅的综合治疗方法，但术后复发率及转移率均较高，因此寻求新的治疗途径及有效的治疗药物具有很大的临床意义。中药野黄芩苷又名灯盏花乙素,是从黄芩茎叶及灯盏细辛等药物中分离得到的黄酮类化合物。已有研究证实黄酮类化合物在抗炎、抗微生物、抗变态反应、抗肿瘤等多方面都有一定的药理作用[1]。本研究观察野黄芩苷对人舌鳞癌Tca8113细胞细胞周期及Fas/FasL介导的细胞凋亡的影响，旨在探讨野黄芩苷可能抗肿瘤的作用机制，为野黄芩苷药理作用的进一步研究提供理论和实验依据。目的：体外培养人舌鳞癌Tca8113细胞株，检测野黄芩苷作用的人舌鳞癌细胞细胞周期改变及Fas、FasL蛋白的表达情况，观察野黄芩苷对人舌鳞癌细胞细胞增殖及凋亡的影响，探讨野黄芩苷的抗肿瘤作用。方法：1、人舌鳞癌Tca8113细胞株购于南京凯基生物科技有限公司，进行体外培养，用于实验。2、实验分组：分为对照组、不同浓度野黄芩苷药物组。对照组用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液培养舌鳞癌细胞;野黄芩苷组根据预实验结果选择用浓度为80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml的野黄芩苷培养液处理细胞。3、采用流式细胞技术观察野黄芩苷作用人舌鳞癌Tca8113细胞48小时后细胞周期的变化。4、采用免疫细胞化学法观察野黄芩苷作用人舌鳞癌Tca8113细胞48小时后Fas、FasL的表达情况。5、采用蛋白印迹(Western-blot)技术检测野黄芩苷作用人舌鳞癌Tca8113细胞48小时后Fas、FasL蛋白的表达情况。6、数据处理采用SPSS17.0统计学软件进行，对结果采用单因素方差分析，P <0.05表示差异有统计学意义。结果：1、流式细胞术检测结果显示：随着加入野黄芩苷浓度的增加，舌鳞癌细胞G1%（DNA合成前期细胞所占百分比）升高，而S%（DNA合成期细胞所占百分比）降低，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05);且这种变化与药物浓度的变化有关，其中以160μg/ml浓度的野黄芩苷抑制作用最强。2、免疫细胞化学染色结果：80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml野黄芩苷作用于Tca8113细胞48h后，Fas和FasL阳性细胞胞浆和胞膜呈棕黄色。对照组细胞胞浆着色很浅，随着药物浓度的增加，细胞胞浆棕黄色逐渐增强，免疫细胞化学染色阳性程度明显高于未经野黄芩苷作用的对照组。经统计学分析，各组之间差异具有统计学意义(P<0.05)，以160μg/ml浓度的野黄芩苷作用最强。3、Western-Blot检测结果：80μg/ml、120μg/ml、160μg/ml野黄芩苷作用于Tca8113细胞48h后，Western-Blot检测对照组Fas、FasL蛋白表达水平较低，不同浓度野黄芩苷药物组随着药物浓度的增加，Fas、FasL蛋白表达量有增高趋势，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：1、野黄芩苷可通过阻止人舌鳞癌Tca8113细胞从G1期进入S期，抑制肿瘤细胞增殖;2、野黄芩苷可能通过提高人舌鳞癌Tca8113细胞Fas蛋白的表达诱导凋亡而达到抗肿瘤的作用。

关键词：野黄芩苷 Tca8113细胞细胞周期 Fas FasL

布鲁氏菌BtpB缺失株构建及其对山羊肺泡巨噬细胞NLRP3炎性体的影响

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布鲁氏菌BtpB缺失株构建及其对山羊肺泡巨噬细胞NLRP3炎性体的影响

作者：李俊玫西北农林科技大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌感染引起的布鲁氏菌病是严重危害我国奶业发展的人兽共患病,由于缺乏安全可靠的疫苗和鉴别诊断手段,一直备受人们关注。深入揭示布鲁氏菌的致病机制,是研发新疫苗和有效防控手段的关键,也是该病目前研究的热点。布鲁氏菌以肺泡... 详细信息

布鲁氏菌感染引起的布鲁氏菌病是严重危害我国奶业发展的人兽共患病,由于缺乏安全可靠的疫苗和鉴别诊断手段,一直备受人们关注。深入揭示布鲁氏菌的致病机制,是研发新疫苗和有效防控手段的关键,也是该病目前研究的热点。布鲁氏菌以肺泡巨噬细胞为靶细胞,在其中复制并干扰巨噬细胞的功能。布鲁氏菌有多种免疫逃避机制,干扰模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)的识别是其隐秘进入宿主细胞及抑制固有免疫反应的关键。BtpB是依赖布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统分泌的一种效应分子,也是目前已知的主要毒力因子之一。NLRP3(NOD-like receptor family member pyrin domain-containing protein 3)作为一种胞内模式识别受体,在病原体入侵的固有免疫反应中发挥重要作用,由其装配形成的NLRP3炎性体是一种存在于胞浆中的大分子多蛋白复合物,能够感知病原微生物感染、组织损伤和代谢失衡时所释放的分子信号。NLRP3激活后促进IL-1β等炎性因子的成熟和释放,促进多种免疫相关基因的表达,并募集淋巴细胞至感染部位,从而抑制病原微生物感染。研究表明,布鲁氏菌感染期间,其Ⅳ型分泌系统效应分子BtpB能以多种方式干扰宿主的天然免疫应答,其中干扰TLRs信号传导,进而抑制下游免疫级联反应是主要方式之一。模式识别受体感受病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)后会引发NLRP3炎性体的激活,然而BtpB作为布鲁氏菌的TIR结构域蛋白与NLRP3炎性体之间的关系仍不清楚,其发挥免疫调节功能的机制也有待进一步研究。为揭示IV型分泌系统效应分子BtpB与布鲁氏菌生长表型及其与NLRP3炎性体活化的关系。本研究通过基因编辑技术构建布鲁氏菌S2株(B.suis S2)BtpB缺失株及其互补株;经扫描电镜观察B.suis S2、BtpB缺失株和互补株的菌体形态,测定生长曲线,及其在酸、热、高渗、氧压力等应激条件下生存率等差别,检测BtpB对布鲁氏菌生长特性的影响;通过细胞试验,利用qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光等相关技术检测BtpB对B.suis S2侵染山羊肺泡巨噬细胞后模式识别受体、NLRP3炎性体组分以及相关炎性因子表达的影响。试验结果如下:1.分别以复苏的B.suis S2和pBBR1MCS5为模板,PCR扩增BtpB上下游同源臂和庆大霉素基因,将三段扩增产物连接到pUC19载体上,构建重组质粒pUC19G-BtpB。酶切、测序鉴定正确后,电击转入B.suis S2感受态细胞。经庆大霉素抗性筛选、PCR鉴定获得BtpB缺失株。PCR扩增BtpB基因,将其连接到表达载体pBB-PZT1上,构建重组质粒pBB-PZT1-BtpB。测序正确后,将其电击转入BtpB缺失株感受态细胞中,利用羧苄抗性筛选阳性克隆,经Western blot鉴定正确后获得BtpB互补株。2.扫描电镜观察B.suis S2、BtpB缺失株和互补株的形态,发现BtpB对布鲁氏菌形态无显著影响。通过检测B.suis S2、BtpB缺失株和互补株的生长曲线及其在山羊肺泡巨噬细胞内的增殖,发现三株菌的胞外及胞内增殖曲线均无显著差异。测定在酸、热、高渗、氧压力等应激条件下三个菌株的生存率,发现与原始菌株和BtpB基因互补株相比,缺失株在氧化应激条件下生存率增加。3.通过qRT-PCR、免疫荧光、Western blot和ELISA检测发现:BtpB缺失株处理组,GAMs细胞TLR2、TLR4表达量上调,与B.suis S2处理组和互补株处理组相比,差异显著;BtpB缺失株处理组NLRP3炎性体相关组分NLRP3、ASC和caspase-1表达量显著升高;同时,NLRP3炎性体下游细胞因子IL-1β表达量显著增加,差异极显著。以上结果表明,BtpB对布鲁氏菌S2株生长特性无显著影响,在布鲁氏菌抑制宿主固有免疫的过程中可能通过NLRP3炎性体途径发挥作用。

关键词：布鲁氏菌S2株 BtpB 山羊肺泡巨噬细胞 NLRP3炎性体

何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺NGF、NGF mRNA表达的影响

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山东医药 2011年第16期51卷 49-51,118页

作者：李俊玫葛志华金小萍承德医学院附属医院河北承德067000

目的观察何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺神经生长因子(NGF)及NGF mRNA表达的影响。方法用D-半乳糖制造衰老大鼠模型,免疫组化及原位杂交法检测何首乌饮预防量、治疗量灌胃后衰老大鼠下颌下腺NGF、NGF mRNA阳性表达的改变。结果预防实验部分... 详细信息

目的观察何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺神经生长因子(NGF)及NGF mRNA表达的影响。方法用D-半乳糖制造衰老大鼠模型,免疫组化及原位杂交法检测何首乌饮预防量、治疗量灌胃后衰老大鼠下颌下腺NGF、NGF mRNA阳性表达的改变。结果预防实验部分NGF、NGF mRNA的表达,模型组与其他各组比较差异均有统计学意义(P(0.05或(0.01),其中以正常组最高,模型组最低,各预防组中预防中剂量组最高。治疗性实验部分NGF、NGF mRNA的表达,自然恢复组与其他各组比较差异均有统计学意义(P(0.01),其中以阴性对照组最高,自然恢复组最低,各治疗组中以治疗中剂量组最高。结论何首乌饮可提高衰老大鼠下颌下腺NGF、NGF mR-NA的表达而达到抗衰老的作用。

关键词：何首乌饮衰老大鼠下颌下腺神经生长因子

D-半乳糖致衰老大鼠下颌下腺神经生长因子及其mRNA的表达

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中国老年学杂志 2011年第20期31卷 3975-3977页

作者：葛志华李俊颖李俊玫孙立新承德医学院附属医院河北承德067000 河北省平泉县医院

目的观察D-半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺神经生长因子(NGF)及NGF mRNA的表达。方法选用SD雌性大鼠18只,随机分为正常组、模型组,用D-半乳糖制造衰老大鼠模型,用免疫组化及原位杂交法检测衰老大鼠下颌下腺NGF、NGF mRNA的阳性表达。结果... 详细信息

目的观察D-半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺神经生长因子(NGF)及NGF mRNA的表达。方法选用SD雌性大鼠18只,随机分为正常组、模型组,用D-半乳糖制造衰老大鼠模型,用免疫组化及原位杂交法检测衰老大鼠下颌下腺NGF、NGF mRNA的阳性表达。结果下颌下腺NGF阳性反应颗粒及NGF mRNA杂交反应产物为浅棕色或深褐色颗粒,NGF阳性反应颗粒主要分布于GCT细胞及纹状管细胞顶部胞质中,腺泡细胞为阴性;NGFmRNA杂交信号主要分布于纹状管和颗粒曲管上皮细胞中,其上皮细胞胞质呈阳性,腺泡细胞为阴性,正常组NGF、NGF mRNA表达明显高于模型组(P<0.01)。结论 D-半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺NGF、NGF mRNA表达较正常大鼠明显减少。

关键词： D-半乳糖衰老下颌下腺 NGF NGF mRNA

何首乌饮对D-半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺EGF、EGF mRNA表达的影响

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中国老年学杂志 2011年第2期31卷 250-252页

作者：葛志华李俊玫冯振林王春艳承德医学院附属医院河北承德067000 承德医学院组胚教研室

目的观察何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺表皮生长因子(EGF)及EGFmRNA表达的影响。方法采用D-半乳糖衰老大鼠模型,何首乌饮干预分为治疗和预防两部分,用免疫组化及原位杂交法检测下颌下腺EGF、EGF mRNA阳性表达的改变。结果预防性实验部分EG... 详细信息

目的观察何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺表皮生长因子(EGF)及EGFmRNA表达的影响。方法采用D-半乳糖衰老大鼠模型,何首乌饮干预分为治疗和预防两部分,用免疫组化及原位杂交法检测下颌下腺EGF、EGF mRNA阳性表达的改变。结果预防性实验部分EGF、EGF mRNA表达以正常组最高,模型组最低,各预防组中预防中剂量组最高,组间比较有高度统计学意义(P<0.01)。治疗性实验部分以正常组最高,自然恢复组最低,各治疗组中以治疗中剂量组最高,组间比较差异显著(P<0.01)。结论何首乌饮可提高下颌下腺EGF、EGF mRNA的表达而达到抗衰老的作用。

关键词：何首乌饮衰老大鼠下颌下腺 EGF EGF mRNA

布鲁氏菌外膜蛋白16单克隆抗体的制备及初步应用

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畜牧兽医学报 2023年第5期54卷 2083-2091页

作者：翟云逸袁野李俊玫田路路刁梓洋李彬陈家露周栋靳亚平王爱华西北农林科技大学动物医学院农业农村部动物生物技术重点实验室杨凌712100

旨在制备布鲁氏菌外膜蛋白16(OMP16)单克隆抗体,建立OMP16抗体竞争ELISA方法,为布病临床防控提供免疫血清学检测手段。本研究选取保守性高、免疫原性良好的布鲁氏菌OMP16,经原核表达获得携带GST或His标签的重组OMP16(rOMP16)。利用杂交... 详细信息

旨在制备布鲁氏菌外膜蛋白16(OMP16)单克隆抗体,建立OMP16抗体竞争ELISA方法,为布病临床防控提供免疫血清学检测手段。本研究选取保守性高、免疫原性良好的布鲁氏菌OMP16,经原核表达获得携带GST或His标签的重组OMP16(rOMP16)。利用杂交瘤技术筛选可稳定分泌OMP16特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,经亚型鉴定、细胞核型分析和抗体交叉反应性试验分析单抗性质。制备小鼠腹水并纯化,方阵滴定法建立布鲁氏菌OMP16抗体竞争ELISA方法。结果表明,成功构建OMP16原核表达系统,经表达、纯化获得rGST-uOMP16和rHis-OMP16。筛选到1株遗传稳定的OMP16特异性杂交瘤细胞株,命名为B7;经鉴定,该抗体亚型为IgM-κ型,可识别目的蛋白,与标签蛋白无交叉反应。建立了布鲁氏菌OMP16抗体竞争ELISA方法,该方法与试管凝集试验检测结果相比总体符合率为90.53%,显示出良好的一致性。本研究有望为布鲁氏菌病的临床防控提供特异性高、敏感性好的免疫血清学检测方法。

关键词：布鲁氏菌外膜蛋白16 原核表达单克隆抗体竞争ELISA

望食指络脉在婴幼儿肺炎合并心衰诊断中的意义

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时珍国医国药 2008年第8期19卷 1925-1926页

作者：李俊玫敬小青刘艳伟承德医学院附属医院河北承德067000

目的探讨食指络脉诊法在婴幼儿肺炎并发心衰诊断中的意义。方法50例婴幼儿肺炎并发心力衰竭患儿每天早晨及午睡后观察其食指络脉的显露部位、充盈程度、流畅程度、形状及颜色变化,并同时记录当时的临床表现及体征。结果47例食指络脉长... 详细信息

目的探讨食指络脉诊法在婴幼儿肺炎并发心衰诊断中的意义。方法50例婴幼儿肺炎并发心力衰竭患儿每天早晨及午睡后观察其食指络脉的显露部位、充盈程度、流畅程度、形状及颜色变化,并同时记录当时的临床表现及体征。结果47例食指络脉长度抵达命关,3例抵达气关;48例充盈明显,2例充盈可疑;49例流畅程度为迟,1例正常;20例形状纡曲,30例食指络脉末梢可见分叉;50例颜色严重青紫,都具有随着病情加重或好转的规律性变化。结论食指络脉诊法在婴幼儿肺炎并发心衰诊断中有一定意义,其对疾病预后和转归的判断、治疗效果的监测有现实意义。

关键词：婴幼儿肺炎食指络脉诊法心衰

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白VceC对山羊滋养层细胞内质网应激和性腺激素分泌的影响

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畜牧兽医学报 2023年第3期54卷 1210-1220页

作者：相彩霞王相国李俊玫支飞杰房姣阳郑维芳陈家露靳亚平王爱华西北农林科技大学动物医学院农业农村部动物生物技术重点实验室杨凌712100

旨在研究布鲁氏菌IV型分泌系统效应分子VceC对山羊滋养层细胞(GTC)内质网应激及性腺激素分泌的影响,为揭示其在布鲁氏菌感染宿主细胞中的作用,阐明布鲁氏菌胞内生存和引起动物流产的机制提供重要依据。本研究通过构建VceC的真核表达载体... 详细信息

旨在研究布鲁氏菌IV型分泌系统效应分子VceC对山羊滋养层细胞(GTC)内质网应激及性腺激素分泌的影响,为揭示其在布鲁氏菌感染宿主细胞中的作用,阐明布鲁氏菌胞内生存和引起动物流产的机制提供重要依据。本研究通过构建VceC的真核表达载体pEGFP-C1-VceC并转染GTC,Western blot检测内质网应激标志性分子GRP78和CHOP蛋白表达量变化,qRT-PCR和Western blot进一步检测未折叠蛋白反应(UPR)信号通路相关分子;ELISA检测细胞培养上清液的孕酮和雌激素的浓度变化。结果表明,成功构建了VceC真核表达载体pEGFP-C1-VceC,转染GTC后,12和24 h GRP78蛋白表达均显著升高(P0.05),Western blot检测IRE1蛋白的表达在转染12 h后显著升高(P0.05)。证明布鲁氏菌VceC不仅能通过激活UPR中的IRE1通路从而激发GTC的内质网应激反应,还能改变GTC中孕酮/雌激素的比值。

关键词：布鲁氏菌 IV型分泌系统 VceC效应蛋白山羊滋养层细胞内质网应激性腺激素