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表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病病毒构建及在中和试验中应用

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中国兽医科学 2024年

作者：任晓祥刘立辉肖娜张帅武月赵云环刘涛左玉柱范京惠河北农业大学动物医学院定州市农业农村局瑞普(保定)生物药业有限公司

为了优化病毒血清中和抗体试验方法，减少传统病毒中和抗体试验的周期，本研究通过同源重组技术，构建出能够表达绿色荧光蛋白的伪狂犬gE基因缺失病毒PRV-ΔgE-AcGFP1。将其作为检测病毒，对gE抗体阴性血清进行病毒血清中和抗体试验，... 详细信息

为了优化病毒血清中和抗体试验方法，减少传统病毒中和抗体试验的周期，本研究通过同源重组技术，构建出能够表达绿色荧光蛋白的伪狂犬gE基因缺失病毒PRV-ΔgE-AcGFP1。将其作为检测病毒，对gE抗体阴性血清进行病毒血清中和抗体试验，测定中和抗体效价。结果显示，利用重组病毒测定中和抗体效价的结果与传统方法无显著差异。结果表明，PRV-ΔgE-AcGFP1可作为攻击病毒用于血清中和抗体试验，为进行方便、准确、周期短的血清中和抗体试验提供一种新的选择。

关键词：伪狂犬病病毒同源重组绿色荧光蛋白中和试验

PRRSV BZ4-19株的分离鉴定及其全基因序列分析

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中国兽医科学 2024年第2期54卷 200-207页

作者：李思琪刘莹刘濮毓任晓祥李岩岩王文钊左玉柱范京惠河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省兽医生物技术创新中心河北保定071001

为了解山东滨州某猪场PRRSV的流行及变异情况,将该猪场采集的疑似PRRSV阳性病料进行RT-PCR检测,检测出的阳性样品用Marc-145细胞进行分离,设计了9对扩增引物用于分离株(BZ4-19)的全基因扩增,将扩增出的全基因序列进行核苷酸及其推导的... 详细信息

为了解山东滨州某猪场PRRSV的流行及变异情况,将该猪场采集的疑似PRRSV阳性病料进行RT-PCR检测,检测出的阳性样品用Marc-145细胞进行分离,设计了9对扩增引物用于分离株(BZ4-19)的全基因扩增,将扩增出的全基因序列进行核苷酸及其推导的氨基酸序列分析。最终成功在Marc-145细胞上分离到1株RespPRRS MLV-like毒株,全基因扩增结果显示其全长为15412 bp(不含polyA尾);核苷酸同源性分析说明,其与美洲经典株VR2332及RespPRRS MLV(疫苗株)同源性最高,分别为99.4%和99.8%。将BZ4-19分离株与VR2332、RespPRRS MLV的氨基酸序列进行比较分析揭示,VR2332与RespPRRS MLV共有30处氨基酸差异,在这30处差异中,分离株与VR2332有7处一致,与RespPRRS MLV有23处一致。在鉴别VR2332与RespPRRS MLV的9处可能与毒力相关的氨基酸位点时,分离株有7处与VR2332相同,由此推测本研究分离到的毒株属于疫苗株RespPRRS MLV返强毒株,我国具有上述分子变化的PRRSV的流行应被关注。

关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV) 经典美洲株 RespPRRS MLV株病毒分离鉴定流行病学

表达CSFV E2线性表位的PCV2病毒样颗粒的制备及免疫原性研究

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中国预防兽医学报 2024年第1期46卷 70-77页

作者：李岩岩张帅赵云环任晓祥李思琪王文钊左玉柱范京惠河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省兽医生物技术创新中心河北保定071001

为制备携带猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP),并在小鼠体内评价其免疫原性,本研究采用PCR扩增PCV2 Cap基因,利用重叠延伸PCR将PCV2 Cap蛋白的诱饵表位(aa169~aa180)替换成编码两个连续的CSFV E2蛋白线性表位(a... 详细信息

为制备携带猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP),并在小鼠体内评价其免疫原性,本研究采用PCR扩增PCV2 Cap基因,利用重叠延伸PCR将PCV2 Cap蛋白的诱饵表位(aa169~aa180)替换成编码两个连续的CSFV E2蛋白线性表位(aa829~aa837)的融合基因(PCV2-Cap^(169~180)-E2^(829~837))经测序鉴定正确后克隆至载体pET-32a(+)中,构建重组质粒p-Cap-E2并采用PCR方法鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白(PCV2-Cap-E2),采用改良的镍亲和层析法纯化重组蛋白,并利用SDS-PAGE与western blot对重组蛋白的表达形式及反应原性鉴定;利用透射电镜观察纯化的重组蛋白能否形成VLP;利用本研究制备的VLP、PCV2及CSFV商品化疫苗分别免疫小鼠,采用ELISA方法检测免疫后不同时间小鼠体内的抗体水平及细胞因子含量。SDS-PAGE结果显示,在49 ku处出现目的条带,且重组蛋白主要以可溶性形式表达,纯化得到单一的目的蛋白;western blot结果显示,重组蛋白能够与猪源PCV2多克隆抗体(PAb)、猪源CSFV PAb及HRP标记的6×His-Tag小鼠单克隆抗体(MAb)发生特异性反应,在49 ku处出现特异性条带;电镜观察可见重组蛋白形成规则的VLP;抗体的ELISA结果显示,与PBS对照相比,VLP能够诱导小鼠产生较高的PCV2及CSFV抗体水平(P<0.01),与各商品化疫苗均无显著差异。细胞因子的ELISA结果显示,与PBS对照组相比,VLP能够诱导小鼠产生较高水平的细胞因子(P<0.01)。体外病毒中和试验结果显示,VLP免疫的小鼠血清中具有中和PCV2的活性。综上所述,本实验首次在大肠杆菌中可溶性表达并获得了纯化的重组蛋白(PCV2-Cap-E2),且其能够在体外自组装成VLP,并可刺激小鼠产生针对PCV2 Cap蛋白及CSFV E2蛋白的特异性抗体,为研制针对PCV2和CSFV的新型二联VLP疫苗提供了物质基础。

关键词：猪圆环病毒2型病毒样颗粒猪瘟病毒E2蛋白 Cap蛋白

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规模化猪场猪蓝耳病防控思路

猪业科学 2024年第4期41卷 32-35页

作者：代飞王敬友张帅赵云环孟子薇范京惠左玉柱河北科星药业有限公司河北石家庄050200 河北农业大学动物医学院河北保定071001

近年来,中国养猪业的规模越来越大,单体养殖场的存栏量越来越多,同时,集约化、规模化、智能化以及行业内高素质人才占比越来越高,尤其是2018年非洲猪瘟进入中国以来,养猪企业在生物安全意识、生物安全硬件以及生物安全的执行标准上都达... 详细信息

近年来,中国养猪业的规模越来越大,单体养殖场的存栏量越来越多,同时,集约化、规模化、智能化以及行业内高素质人才占比越来越高,尤其是2018年非洲猪瘟进入中国以来,养猪企业在生物安全意识、生物安全硬件以及生物安全的执行标准上都达到了世界一流水平。

关键词：非洲猪瘟养猪企业猪蓝耳病规模化猪场世界一流水平存栏量生物安全意识养殖场

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非洲猪瘟病毒研究进展

中国兽医学报 2022年第12期42卷 2569-2577页

作者：张帅刘媛赵云环刘莹左玉柱范京惠河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省邢台市邢东新区社会发展局动物卫生监督所河北邢台054000 河北省兽医生物技术创新中心河北保定071001

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的猪的一种高度接触性、致死性传染病,病死率可达100%,世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的疫病,在我国被列为一类动物疫病。因ASFV... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的猪的一种高度接触性、致死性传染病,病死率可达100%,世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的疫病,在我国被列为一类动物疫病。因ASFV具有庞大的基因组和复杂的免疫逃逸机制,给疫苗的研发带来了困难,目前尚无商品化的疫苗用于本病的防制。为了更深入地了解ASFV,加快ASF疫苗的研发进程,做到对ASF的有效防制,重点对ASFV基础病毒学的最新研究发现与成果进行综述,主要集中在ASFV的蛋白质功能与作用机制、诊断方法以及疫苗的开发进展方面,以期为ASF的有效防制奠定基础。

关键词：非洲猪瘟病毒蛋白功能诊断方法非洲猪瘟疫苗

河北部分地区猪圆环病毒2型分离鉴定及遗传变异分析

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中国兽医学报 2022年第5期42卷 853-861页

作者：赵云环赵强刘莹张帅郭禹左玉柱范京惠河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省兽医生物技术创新中心河北保定071001

为了解河北省猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)基因型感染及遗传变异情况,对采自河北省6个不同地区的32份疑似PCV2感染的组织通过PCR进行初步鉴定,并将鉴定为阳性的组织通过接种PK-15细胞分离病毒,通过PCR、间接免疫荧光... 详细信息

为了解河北省猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)基因型感染及遗传变异情况,对采自河北省6个不同地区的32份疑似PCV2感染的组织通过PCR进行初步鉴定,并将鉴定为阳性的组织通过接种PK-15细胞分离病毒,通过PCR、间接免疫荧光、透射电镜对分离的病毒进行鉴定,利用特异性引物对PCV2进行PCR全基因序列扩增,测序后进行全基因及ORF2基因核苷酸序列分析。结果显示,32份疑似样品中有13份PCV2阳性组织,阳性率为40.65%。对其中1份仅感染PCV2的样品进行病毒的细胞分离及后续鉴定,得到1株可稳定感染和增殖的PCV2毒株。将初步筛选的阳性组织进行PCV2全基因扩增并测序,得到8株PCV2全基因序列,基因组全长均为1768 bp;8株PCV2全基因同源性比对结果为95%~99.8%,ORF2同源性比对结果为94%~100%;遗传进化分析显示,8个分离株归属于3个基因亚型(PCV2a、PCV2b和PCV2d),同源性氨基酸序列分析显示主要变异区在47~63 aa抗原表位区。本试验结果为进一步研究该地区PCV2分子流行病学及相关疾病的免疫防控奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型分离鉴定遗传进化分析

基于ASFV EP402R编码蛋白CD2v的生物信息学分析

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河北农业大学学报 2022年第2期45卷 92-98页

作者：张帅顾文源赵云环刘莹左玉柱范京惠河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省动物疫病预防控制中心河北石家庄050035 河北省兽医生物技术创新中心河北保定071001

为深入了解非洲猪瘟病毒(ASFV)的EP402R编码蛋白CD2v结构与功能的关系和病毒-宿主作用机制,本研究通过在线工具对Pig/HLJ/2018中国分离株CD2v蛋白进行了遗传进化和生物信息学分析。结果显示:Pig/HLJ/2018株与格鲁吉亚Georgia 2007、Geor... 详细信息

为深入了解非洲猪瘟病毒(ASFV)的EP402R编码蛋白CD2v结构与功能的关系和病毒-宿主作用机制,本研究通过在线工具对Pig/HLJ/2018中国分离株CD2v蛋白进行了遗传进化和生物信息学分析。结果显示:Pig/HLJ/2018株与格鲁吉亚Georgia 2007、Georgia 2008以及其他中国毒株处于同一分支,基因型同为Ⅱ型;同一基因型CD2v蛋白氨基酸序列一致性高达100%,不同基因型间蛋白氨基酸序列表现出差异,氨基酸一致性在76.8%~81.7%之间;该CD2v蛋白表达的蛋白大小为41.00889 kD;蛋白结构主要以无规卷曲为主;存在信号肽和跨膜区;存在4个优势B细胞表位和5个T细胞表位。结果表明:当前中国流行株为基因Ⅱ型;CD2v蛋白在ASFV入侵机体、免疫逃逸等过程中扮演重要角色,为ASFV的深入研究和ASF的防治奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟 CD2v 作用机制生物信息学

猪流行性腹泻病毒CH/HB/CZ01的分离鉴定及致病性研究

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中国动物传染病学报 2022年

作者：翟刚刘莹赵云环刘濮毓王传文李妍范京惠左玉柱河北农业大学动物医学院河北省兽医生物技术创新中心

为了获得猪流行性腹泻病毒（PEDV）的地方分离株，并对其生物学特性和致病性进行初步了解。本研究在河北省开展猪流行性腹泻病毒（PEDV）的收集与分离鉴定，并进行遗传进化分析，同时评价分离毒株在仔猪上的致病性。将在该地区收集到的P...

为了获得猪流行性腹泻病毒（PEDV）的地方分离株，并对其生物学特性和致病性进行初步了解。本研究在河北省开展猪流行性腹泻病毒（PEDV）的收集与分离鉴定，并进行遗传进化分析，同时评价分离毒株在仔猪上的致病性。将在该地区收集到的PEDV样品接种Vero细胞连续盲传，经RT-PCR检测以及基因测序鉴定，成功分离了CH/HB/CZ01毒株。利用GenBank中公布的PEDV毒株序列对该毒株进行S基因的遗传进化分析，结果显示，该毒株与我国近年来流行毒株序列的同源性为97.1%～98.3%，明显高于CV777、LZC和DR13等传统毒株的同源性，属于GⅡb亚群。将分离的PEDV病毒液按照2.0 ml/头接种健康仔猪，均出现腹泻等症状且接种2日后直肠拭子经RT-PCR鉴定均为PEDV阳性。结果表明，分离株为变异毒株具有较强的致病性，为掌握河北省PEDV最新流行毒株的基因组特性以及生物学特性研究奠定了初步基础。

关键词：

猪流行性腹泻病毒TaqMan检测方法的建立及基于S基因的遗传变异分析

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畜牧兽医学报 2023年第2期54卷 847-854页

作者：翟刚顾文源刘涛刘莹张帅范京惠左玉柱河北农业大学动物医学院保定071001 河北省兽医生物技术创新中心保定071001 河北省动物疫病预防控制中心石家庄050000 瑞普(保定)生物药业有限公司保定071001

旨在建立一种能快速、高效且灵敏的检测出猪流行性腹泻病毒(PEDV)的通用型TaqMan qPCR检测方法,并进一步了解河北省PEDV的遗传变异情况。本研究参考PEDV变异株AJ1102的M基因的保守区域设计特异性引物及探针,对引物浓度、退火温度等条件... 详细信息

旨在建立一种能快速、高效且灵敏的检测出猪流行性腹泻病毒(PEDV)的通用型TaqMan qPCR检测方法,并进一步了解河北省PEDV的遗传变异情况。本研究参考PEDV变异株AJ1102的M基因的保守区域设计特异性引物及探针,对引物浓度、退火温度等条件进行优化,建立了一种应用于猪场筛查PEDV的qPCR方法,并对筛查出的阳性样品S基因扩增测序后进行遗传进化分析。结果显示:该方法的特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)及传染型胃肠炎病毒(TGEV)等猪病常见病原均无交叉反应;建立的检测方法对pMD19T-PEDV标准品的最低检测下限为1.09×101拷贝·μL^(-1),比普通PCR灵敏约100倍,敏感性高;组内和组间的变异系数均小于1%,重复性良好。基于S全基因成功克隆出的9条序列分布于GⅡ的两个亚群,克隆的9条序列的核苷酸相似性为96.6%~99.1%;氨基酸的相似性为94.6%~98.7%。结果表明:本研究得到的PEDV流行株与近年来国内分离株的关系较为密切,而与中国目前使用的疫苗株以及欧洲株亲缘关系较远,这表明河北部分地区PEDV当前流行毒株比较复杂且有变异的趋势,提示持续检测PEDV流行毒株变异动态的必要性。本研究不仅为PEDV的临床诊断提供了技术支持,更为进一步掌握PEDV遗传进化规律提供了参考依据。

关键词：猪流行性腹泻病毒 qPCR S基因遗传变异分析