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B型流感病毒感染性克隆的构建及其免疫原性研究

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B型流感病毒感染性克隆的构建及其免疫原性研究

作者：孙伟洋中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

B型流感病毒(Influenza B virus)是正黏病毒科流感病毒属的成员,是单股、负链、分节段的RNA病毒,以B/Yamagata/16/88和B/Victoria/2/87为代表株分为两个谱系。B型流感病毒的形态与A型流感病毒相似,但只感染人类。作为季节性流感的一种,... 详细信息

B型流感病毒(Influenza B virus)是正黏病毒科流感病毒属的成员,是单股、负链、分节段的RNA病毒,以B/Yamagata/16/88和B/Victoria/2/87为代表株分为两个谱系。B型流感病毒的形态与A型流感病毒相似,但只感染人类。作为季节性流感的一种,B型流感病毒常在流感季节里引起局部的暴发和流行。流行病学监测结果表明,每年流行的B型流感病毒谱系并不相同。这对其免疫预防提出了挑战。基于反向遗传学技术,对流感病毒基因片段进行基因重配和基因重组,进而快速生产流感疫苗,是流感疫苗研究的一个新的重要方向。实验目的:本研究拟构建B型流感病毒B/Yamagata/16/88株的感染性克隆即反向遗传操作平台,并对拯救病毒株的致病性、免疫原性和免疫保护效力进行初步评价,为下一步以该平台为基础筛选B型流感病毒减毒疫苗株打下基础。实验内容及方法:1.B型流感病毒B/Yamagata/16/88株的反向遗传操作系统的构建和鉴定。(1)根据Genbank上公布的B/Yamagata/16/88株的基因序列,对其内部8个基因片段进行全基因合成,并设计其反向引物。(2)将8个基因片段分别与PBD载体进行连接,通过分子克隆等方法构建8个转染质粒,进行PCR鉴定和测序鉴定。(3)将鉴定正确的8个转染质粒共转染293T细胞和SPF级鸡胚,进行病毒的拯救,拯救的B型流感病毒即亲本株,命名为B-S9。(4)对拯救的病毒进行形态学、分子生物学鉴定,并检测其毒力及其在MDCK细胞的复制情况。2.拯救病毒株B-S9的致病性实验。(1)测定拯救病毒株B-S9的EID50结果,将BS9分别稀释成106 EID50/50μl、105EID50/50μl等不同剂量,鼻腔接种麻醉后的BALB/c小鼠。(2)106 EID50攻毒剂量组,在攻毒后第3天取小鼠肺脏、鼻甲骨、脑、肝、脾、肾及肠等组织,第6天取小鼠的肺脏;105EID50攻毒剂量组小鼠,在攻毒后第3天和第6天分别取肺脏,用SPF鸡胚滴定各组织的病毒滴度。(3)攻毒后14d内称量各组小鼠体重,并观察死亡情况。3.拯救病毒株B-S9的免疫原性实验。(1)将BALB/c小鼠分为滴鼻组和肌注组,滴鼻组小鼠鼻腔接种105 EID50/50μl的病毒液,肌注组注射256倍血凝效价单位的灭活的B-S9病毒。(2)两组小鼠免疫三周后,采集小鼠血清,以拯救病毒株B-S9为抗原,分别检测两组小鼠血清的中和抗体效价和血凝抑制抗体效价。(3)以2013-2014候选疫苗株NYMC BX-51B为抗原,分别检测两组小鼠血清中的血凝抑制抗体效价。4.拯救病毒株B-S9的免疫保护实验。(1)将病毒株B-S9分别以鼻腔接种和肌肉注射两种方式对BALB/c小鼠进行免疫,3周后攻毒。(2)用106 EID50/50μl剂量的亲本株B-S9和106 EID50/50μl剂量的2013-2014候选疫苗株NYMC BX-51B对免疫小鼠进行攻毒,观察14d内小鼠死亡情况,并称量小鼠体重。(3)攻毒第3天和第6天分别取各组小鼠的肺脏组织,进行脏器滴定。实验结果:1.拯救了一株B型流感病毒B/Yamagata/16/88株,拯救的病毒株命名为B-S9。PCR鉴定显示和B型流感病毒各基因片段大小一致;B-S9进行RT-PCR测序后,经过比对,其序列和Genbank上公布的一致;电镜下观察到流感病毒粒子。B-S9在SPF级鸡胚和MDCK细胞上病毒的毒力分别为108.75 EID50/ml和107.5 TCID50/ml,并测定其在MDCK细胞的生长曲线。2.攻毒剂量105EID50组和106EID50组小鼠体重明显下降,对照组小鼠体重缓慢上升,不同攻击剂量组的小鼠生存率均为100%。在14d观察期内,小鼠未出现死亡情况,所以其MLD50>106.5 EID50。B-S9仅在肺脏和鼻甲骨中复制,其他组织未检测到病毒。感染小鼠的肺脏病毒滴定结果表明病毒株B-S9的复制高峰在第3天,第6天时病毒的滴度下降。3.小鼠免疫实验中,以拯救病毒株B-S9为抗原,中和抗体检测结果表明滴鼻免疫比肌注免疫的中和抗体效价高,小鼠血清中的血凝抑制抗体检测结果是滴鼻组高于肌注组。用2013-2014候选疫苗株NYMC BX-51B进行HI检测,显示两组小鼠血清中也有该病毒的HI抗体,但是效价较低。4.免疫小鼠经亲本株B-S9攻毒后,对照组体重下降明显,滴鼻组未有明显下降,肌注组有小幅下降。滴鼻组小鼠肺脏未有病毒复制,肌注组小鼠肺脏仅在第3天检测到病毒复制,对照组小鼠有高水平复制。免疫小鼠经2013-2014候选疫苗株NYMC BX-51B攻毒后,滴鼻组、肌注组小鼠体重变化不大,对照组小鼠体重小幅下降。滴鼻免疫小鼠肺脏没有检测到病毒的复制,肌注组小鼠肺脏病毒复制第3天要高

关键词： B型流感病毒反向遗传学致病性免疫原性免疫保护

SARS-CoV-2细菌样颗粒对小鼠的免疫原性及攻毒保护效果评价

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中国病原生物学杂志 2023年第7期18卷 745-749,758页

作者：苏日娜石壮壮任娟罗敏王铁成冯娜王建忠夏咸柱孙伟洋高玉伟吉林农业大学吉林长春130000 中国农业科学院长春兽医研究所山东师范大学

目的本研究以C57BL/6N小鼠为模型,评价SARS-CoV-2细菌样颗粒(Bacterium-Like Particles,BLPs)的免疫原性和攻毒保护效果,为新型冠状病毒感染(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)疫苗研发提供新思路。方法使用SARS-CoV-2细菌样颗粒Trim-RBD-GEM分别在第0、21 d滴鼻免疫C57BL/6N小鼠,在第7、14、21、28、35 d采小鼠血,分离血清,采用ELISA检测特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平。在免疫后第35 d使用50 LD50的C57MA14毒株对C57BL/6N小鼠进行攻毒,记录攻毒后14 d内小鼠体重变化及存活情况;在攻毒后第3 d取小鼠的鼻甲骨和肺脏组织,测定鼻甲骨和肺脏组织中的病毒滴度和病毒载量。另取肺脏组织,使用4%多聚甲醛固定后制作病理切片并染色,观察肺脏组织病理变化,免疫组化法检测病毒蛋白的表达。结果Trim-RBD-GEM滴鼻免疫小鼠后诱导产生特异性抗体,IgG、IgG1和IgG2a抗体水平均显著升高。从攻毒后第1 d开始Trim-RBD-GEM组小鼠体重出现下降,第4 d体重逐步回升,观察期小鼠均存活,存活率为100%;Mock组小鼠在攻毒后第7 d体重均下降至75%以下,且所有小鼠均死亡,存活率为0。攻毒后Trim-RBD-GEM组小鼠肺脏组织中病毒滴度显著低于mock组(P<0.05)。攻毒后第3 d取各组小鼠肺脏做组织病理学检查,Trim-RBD-GEM组小鼠局部支气管管腔内可见少量巨噬细胞浸润,mock组小鼠肺脏切片中多处支气管管腔内可见坏死细胞碎片;免疫组化试验显示mock组小鼠肺脏切片检测到SARS-CoV-2的N蛋白。结论Trim-RBD-GEM滴鼻免疫小鼠可诱导产生特异性IgG抗体,可为COVID-19疫苗的研发提供参考。

关键词： SARS-CoV-2细菌样颗粒 C57BL/6N小鼠滴鼻免疫免疫原性攻毒保护

B型流感病毒NS1蛋白羧基端缺失对病毒致病性的影响分析

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病毒学报 2015年第4期31卷 404-409页

作者：李雪于志君孙伟洋陈强王铁成杨松涛黄耕高玉伟夏咸柱张雪梅长春生物制品研究所有限责任公司长春130012 军事医学科学院军事兽医研究所长春130122 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室长春130122 北京协和医学院和中国医学科学院医学实验动物研究所北京100021

本研究利用基因工程技术探索B型流感病毒NS1蛋白羧基端缺失对病毒致病性的影响,并利用反向遗传学技术从体外拯救NS1蛋白羧基端缺失的B型流感病毒,评估去除NS1蛋白羧基端对B型流感病毒致病性的影响,探究B型流感病毒致病性变异的分子基础... 详细信息

本研究利用基因工程技术探索B型流感病毒NS1蛋白羧基端缺失对病毒致病性的影响,并利用反向遗传学技术从体外拯救NS1蛋白羧基端缺失的B型流感病毒,评估去除NS1蛋白羧基端对B型流感病毒致病性的影响,探究B型流感病毒致病性变异的分子基础。通过全基因合成和反向遗传学技术从体外拯救NS1蛋白羧基端发生171个氨基酸缺失的B型流感病毒B/Yamagata/16/88株,命名为B-L5。将实验室之前拯救的母本株B/Yamagata/16/88(以下简称B-S9)和B-L5以3×105 EID5 0的攻毒剂量分别人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、生存率、肺脏病毒滴度等方面进行致病性分析。成功构建了B型流感病毒B/Yamagata/16/88NS1蛋白羧基端缺失株反向遗传平台。母本株B-S9和NS1蛋白羧基端缺失株B-L5均能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠均呈现低致病性;B-S9感染小鼠后,从攻毒后第3d至第7d,体重持续下降,相反,B-L5感染小鼠后,只在攻毒后第2d出现体重下降,攻毒后第3d体重开始回升;B-S9和B-L5感染小鼠后均能在小鼠肺部进行复制,但攻毒后第3d,B-L5感染小鼠肺脏滴度要比B-S9低7 900倍,攻毒后第6d,B-L5感染小鼠肺脏已检测不到病毒复制。实验结果表明,NS1蛋白羧基端缺失可以明显降低B型流感病毒对小鼠的致病性。B型流感病毒致病性变异的分子基础还有待继续研究,该反向遗传操作系统的建立为B型流感病毒分子机制的研究奠定了基础,同时也为B型流感减毒活疫苗的研究开辟了新途径。

关键词： B型流感病毒反向遗传操作致病性 NS1蛋白

H1N1嵌合冷适应疫苗株的构建及其生物学特性分析与鉴定

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中国病原生物学杂志 2023年第5期18卷 497-501,507页

作者：李东旭孙伟洋赵梦琳孙悦朱梦涵刘夏薇苏日娜武毓姝任娟罗敏王铁成冯娜夏咸柱高玉伟闫芳山西农业大学山西晋中030801 中国农业科学院长春兽医研究所东北师范大学河南大学吉林农业大学山东师范大学

目的应用反向遗传技术构建以B型流感病毒冷适应株为骨架表达季节性流感病毒H1N1 HA蛋白的嵌合疫苗株。方法将B型流感病毒冷适应株B/Vienna/1/99的HA片段胞外区替换为H1N1(A/Victoria/2570/2019)的HA蛋白,将重组质粒与骨架株的其余7个质... 详细信息

目的应用反向遗传技术构建以B型流感病毒冷适应株为骨架表达季节性流感病毒H1N1 HA蛋白的嵌合疫苗株。方法将B型流感病毒冷适应株B/Vienna/1/99的HA片段胞外区替换为H1N1(A/Victoria/2570/2019)的HA蛋白,将重组质粒与骨架株的其余7个质粒共转染293T细胞,拯救H1N1嵌合疫苗株。对重组病毒株进行血凝鉴定、RT-PCR鉴定、电镜鉴定、一步生长曲线绘制以及小鼠安全性评价。结果成功拯救出H1N1嵌合流感病毒株,命名为rA/B-H1-Vic。经测序鉴定其序列与预期一致,并且在电镜下观察到流感病毒粒子的典型特征。H1N1嵌合流感病毒株血凝效价最高达2^(5),在MDCK细胞上的病毒滴度为10^(4.5) TCID_(50)/mL,在鸡胚中的病毒滴度为10^(8.36)EID_(50)/mL。分别以10^(6) EID_(50)和10^(5) EID_(50)剂量鼻腔接种小鼠,其体重与对照组相比无明显下降,小鼠存活率100%,攻毒后第3 d仅在小鼠鼻甲骨和肺脏组织检测到低水平的病毒复制。结论成功拯救出无毒力的H1N1嵌合疫苗株,为流感病毒新型疫苗的研制提供了新的思路。

关键词： H1N1嵌合疫苗株 HA 嵌合疫苗反向遗传技术

新型冠状病毒RBD区重组流感病毒的拯救及初步鉴定

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中国病原生物学杂志 2022年第2期17卷 125-129,135页

作者：王振飞孙伟洋王宇田赵梦琳王文琪朱梦涵孙悦李东旭徐嘉奇王铁成冯娜杨松涛赵永坤夏咸柱高玉伟吉林农业大学吉林长春130118 中国农业科学院长春兽医研究所

目的利用流感反向遗传技术,以B型流感病毒B/Yamagata/16/88株作为骨架,表达新型冠状病毒(SARSCoV-2)S蛋白的受体结合域(RBD),构建以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株。方法基因合成新冠病毒参考株S蛋白上的RBD基因片段(318-54... 详细信息

目的利用流感反向遗传技术,以B型流感病毒B/Yamagata/16/88株作为骨架,表达新型冠状病毒(SARSCoV-2)S蛋白的受体结合域(RBD),构建以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株。方法基因合成新冠病毒参考株S蛋白上的RBD基因片段(318-541aa),对B型流感病毒B/Yamagata/16/88/的NS1片段进行设计改造并插入RBD序列,构建重组质粒NS110-RBD。将NS110-RBD与其余7个骨架株重组质粒共转染293T细胞和MDCK细胞,拯救表达新型冠状病毒RBD区重组流感病毒,对拯救出的毒株进行形态学、分子生物学鉴定及病毒滴度和Western blot检测。结果成功拯救出重组流感病毒株并命名为rIBV-NS110-RBD。PCR鉴定RBD目的基因大小正确,测序表明拯救病毒株的序列正确,在透射电镜下观察到拯救病毒株的病毒粒子具有流感病毒粒子的典型特征。经测定,拯救株rIBV-NS110-RBD在MDCK细胞上的病毒滴度为10^(5.5) TCID_(50)/ml,在鸡胚上的病毒滴度为10^(6.5) EID_(50)/ml,血凝效价最高达2_(5);Western Blot检测到RBD的表达,其分子质量为35ku。结论成功拯救出高表达新型冠状病毒RBD蛋白的高血凝效价的重组流感病毒株,该病毒具有流感病毒粒子的典型特征,为以B型流感病毒为载体作为新型冠状病毒疫苗的研发提供了新思路。

关键词：新型冠状病毒 B型流感病毒反向遗传学 RBD

等角贴敷压电分流片圆柱壳有限元建模及减振分析

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吉林大学学报（工学版） 2024年第2期54卷 365-374页

作者：孙伟杨俊东北大学机械工程与自动化学院沈阳110819 东北大学航空动力装备振动及控制教育部重点实验室沈阳110819

考虑到圆柱壳结构容易出现花瓣型振型的特点,提出了一种等角贴敷多个压电分流片来对其进行振动抑制的方法。基于ANSYS平台,实现圆柱壳与压电片结构耦合,给出了分流电路中电子元件参数输入方法以及和压电片之间的耦合过程。以等角贴敷4... 详细信息

考虑到圆柱壳结构容易出现花瓣型振型的特点,提出了一种等角贴敷多个压电分流片来对其进行振动抑制的方法。基于ANSYS平台,实现圆柱壳与压电片结构耦合,给出了分流电路中电子元件参数输入方法以及和压电片之间的耦合过程。以等角贴敷4个压电分流片圆柱壳为对象进行实例研究,证明了建模方法的合理性以及压电分流阻尼对圆柱壳的减振效果。在此基础上进行参数影响分析,可以发现:对于电阻分流电路存在一个最优电阻值可使减振效果最优;压电片贴敷在变形相对大的区域以及增大尺寸对减振有利。

关键词：机械设计及理论压电分流薄壁圆柱壳有限元建模减振分析等角度贴敷

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世界级机场群航空网络时空演化特征与模式

地理学报 2024年第6期79卷 1540-1555页

作者：张蕾孙伟宋彦江苏第二师范学院地理科学学院南京210000 中国科学院南京地理与湖泊研究所南京210000 美国北卡罗莱纳大学教堂山分校城市与区域规划系美国教堂山27599

机场群已经成为航空运输地理学的新兴研究领域。利用社会网络分析方法对1993—2018年美国东北走廊地区世界级机场群航空网络时空演化进行验证分析,发现该区域航空网络经历了从形成期到成熟期的转变:①“核心—边缘”结构特征趋于显著,... 详细信息

机场群已经成为航空运输地理学的新兴研究领域。利用社会网络分析方法对1993—2018年美国东北走廊地区世界级机场群航空网络时空演化进行验证分析,发现该区域航空网络经历了从形成期到成熟期的转变:①“核心—边缘”结构特征趋于显著,核心机场与边缘机场的运量差距拉大,相互联系减少,而核心机场快速成长,彼此联系加密,部分枢纽的国内国际中转功能持续增强;②轴辐结构特征逐渐清晰,轮辐机场连接枢纽机场数量减少,航线更加聚焦,尤其倾向连接邻近多机场系统的枢纽机场;③航空网络的小世界特征和节点异配性明显,但轮辐机场连接的枢纽数量减少导致簇系数降低,轴辐结构的形成削弱了航空网络的小世界特征。基于实证分析,本文构建了一个中小尺度下的机场群航空网络演化模型,研究可为航空网络演化理论发展提供实证基础,也可为国内规划建设世界级机场群提供理论与实证参考。

关键词：时空演化特征世界级机场群航空网络演化模式

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我国野鸟新城疫病毒流行调查及遗传进化分析

中国病原生物学杂志 2023年第3期18卷 249-253,259页

作者：王文浩于明远李元果梁宏蕊胡鑫宇李敏李方旭赵艳斌宋丹丹陈艳艳孔云逸王铁成孙伟洋高玉伟解林红王磊河南科技学院动物科技学院河南新乡453003 中国农业科学院长春兽医研究所国家林业和草原局生物灾害防控中心山东师范大学生命科学学院

目的掌握我国野鸟中新城疫病毒(NDV)的流行及遗传进化特征。方法结合候鸟的分布、迁徙规律以及栖息环境等信息,在途经中国的东亚-澳大利亚和西太平洋候鸟迁徙路线及其他重要野鸟栖息、停歇地作为监测哨点,采集环境样品、组织及咽肛拭子... 详细信息

目的掌握我国野鸟中新城疫病毒(NDV)的流行及遗传进化特征。方法结合候鸟的分布、迁徙规律以及栖息环境等信息,在途经中国的东亚-澳大利亚和西太平洋候鸟迁徙路线及其他重要野鸟栖息、停歇地作为监测哨点,采集环境样品、组织及咽肛拭子等样品进行NDV鉴定,阳性样品按照地域、物种和采集时间划分挑取代表株并进行F基因序列测定,构建NJ进化树并分析F蛋白裂解位点。结果2013-2021年共采集环境样品、拭子及组织样品113017份,分离获得67株候鸟NDV,均来自常规监测中采集的拭子和环境样品,死亡野鸟中未检出NDV。历年野鸟中NDV的分离率分别为:2013年0.21%,2014年0.23%,2015年0.04%,2016年0.05%,2017年0.03%,2018年0.03%,2020年0.06%,2021年0.01%。F基因遗传进化分析表明,26株代表株中有20株NDV为ClassⅠ(14株genotypeⅠ.1.1.2,6株genotypeⅠ.1.2),宿主分布为苍鹭、赤麻鸭、斑嘴鸭、红腹滨鹬、海鸬鹚及鸥类;6株NDV为ClassⅡ(1株为genotypeⅠ.1.1,1株为genotypeⅠ.1.2.1,4株为genotypeⅠ.2),宿主分布为豆雁、翘嘴鹬、绿头鸭、红头潜鸭。经F蛋白裂解位点分析,26株新城疫病毒代表株均符合弱毒株分子特征。结论新城疫病毒野鸟宿主种类呈多样性,且同时存在ClassⅠ和ClassⅡ两类新城疫弱毒株。可为我国野鸟中新城疫病毒的流行、进化和宿主多样性提供数据资料。

关键词：新城疫病毒野鸟多样性遗传进化分析

通用H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的制备

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中国病原生物学杂志 2019年第7期14卷 755-760页

作者：刘静任志广王铁成李元果孙伟洋冯娜秦川高玉伟夏咸柱北京协和医学院中国医学科学院医学实验动物研究所北京100021 军事医学科学院军事兽医研究所河南大学医学院

目的高致病性H5N1亚型流感病毒可感染人,并不断衍生出多个新的基因谱系,存在着大规模流行的可能性。我国现有的商品化疫苗无法对不同谱系的H5N1流感病毒感染提供有效的保护。病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗具有良好的免疫... 详细信息

目的高致病性H5N1亚型流感病毒可感染人,并不断衍生出多个新的基因谱系,存在着大规模流行的可能性。我国现有的商品化疫苗无法对不同谱系的H5N1流感病毒感染提供有效的保护。病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗具有良好的免疫原性和安全性,成为近年研究的热点。本研究旨在建立H5亚型禽流感病毒通用型病毒样颗粒疫苗的制备方法。方法将优化的H5N1A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(clade 2.***.2.1)亚型流感病毒的HLHA(HA stem)/5M2e(5个M2e)/HL5M2e(5M2e替代HA的头部嵌入HLHA)、NP基因和M1基因分别插入pFast-BacDual载体,得到相应的重组供体。然后将重组供体转化至含Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,获得含有目的基因的重组杆粒。结果酶切和PCR鉴定表明成功构建了含目的基因的重组杆粒Bacmid-(HLHA/5M2e/HL5M2e、NP、M1)。将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,IFA试验和Western blot试验皆证实,优化的HLHA(HA stem)/5M2e/HL5M2e、NP基因和M1基因编码的蛋白均获得表达。透射电子显微镜观察VLPs转染Sf9细胞上清的浓缩液中,有球形结构和100nm左右典型VLPs存在。结论在Sf9昆虫杆状病毒表达系统中成功表达H5N1A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(clade 2.***.2.1)亚型禽流感病毒的HLHA(HA stem)/5M2e/HL5M2e、NP和M1蛋白,并组装成3种VLPs,为进一步研究流感病毒的VLPs疫苗奠定了基础。

关键词：流感病毒基因优化 HLHA(HA stem)/5M2e/HL5M2e NP M1 病毒样颗粒