B型流感病毒感染性克隆的构建及其免疫原性研究

作     者：孙伟洋 

作者单位：中国人民解放军军事医学科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：夏咸柱

授予年度：2015年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：B型流感病毒 反向遗传学 致病性 免疫原性 免疫保护 

摘      要：B型流感病毒(Influenza B virus)是正黏病毒科流感病毒属的成员,是单股、负链、分节段的RNA病毒,以B/Yamagata/16/88和B/Victoria/2/87为代表株分为两个谱系。B型流感病毒的形态与A型流感病毒相似,但只感染人类。作为季节性流感的一种,B型流感病毒常在流感季节里引起局部的暴发和流行。流行病学监测结果表明,每年流行的B型流感病毒谱系并不相同。这对其免疫预防提出了挑战。基于反向遗传学技术,对流感病毒基因片段进行基因重配和基因重组,进而快速生产流感疫苗,是流感疫苗研究的一个新的重要方向。实验目的:本研究拟构建B型流感病毒B/Yamagata/16/88株的感染性克隆即反向遗传操作平台,并对拯救病毒株的致病性、免疫原性和免疫保护效力进行初步评价,为下一步以该平台为基础筛选B型流感病毒减毒疫苗株打下基础。实验内容及方法:1.B型流感病毒B/Yamagata/16/88株的反向遗传操作系统的构建和鉴定。(1)根据Genbank上公布的B/Yamagata/16/88株的基因序列,对其内部8个基因片段进行全基因合成,并设计其反向引物。(2)将8个基因片段分别与PBD载体进行连接,通过分子克隆等方法构建8个转染质粒,进行PCR鉴定和测序鉴定。(3)将鉴定正确的8个转染质粒共转染293T细胞和SPF级鸡胚,进行病毒的拯救,拯救的B型流感病毒即亲本株,命名为B-S9。(4)对拯救的病毒进行形态学、分子生物学鉴定,并检测其毒力及其在MDCK细胞的复制情况。2.拯救病毒株B-S9的致病性实验。(1)测定拯救病毒株B-S9的EID50结果,将BS9分别稀释成106 EID50/50μl、105EID50/50μl等不同剂量,鼻腔接种麻醉后的BALB/c小鼠。(2)106 EID50攻毒剂量组,在攻毒后第3天取小鼠肺脏、鼻甲骨、脑、肝、脾、肾及肠等组织,第6天取小鼠的肺脏;105EID50攻毒剂量组小鼠,在攻毒后第3天和第6天分别取肺脏,用SPF鸡胚滴定各组织的病毒滴度。(3)攻毒后14d内称量各组小鼠体重,并观察死亡情况。3.拯救病毒株B-S9的免疫原性实验。(1)将BALB/c小鼠分为滴鼻组和肌注组,滴鼻组小鼠鼻腔接种105 EID50/50μl的病毒液,肌注组注射256倍血凝效价单位的灭活的B-S9病毒。(2)两组小鼠免疫三周后,采集小鼠血清,以拯救病毒株B-S9为抗原,分别检测两组小鼠血清的中和抗体效价和血凝抑制抗体效价。(3)以2013-2014候选疫苗株NYMC BX-51B为抗原,分别检测两组小鼠血清中的血凝抑制抗体效价。4.拯救病毒株B-S9的免疫保护实验。(1)将病毒株B-S9分别以鼻腔接种和肌肉注射两种方式对BALB/c小鼠进行免疫,3周后攻毒。(2)用106 EID50/50μl剂量的亲本株B-S9和106 EID50/50μl剂量的2013-2014候选疫苗株NYMC BX-51B对免疫小鼠进行攻毒,观察14d内小鼠死亡情况,并称量小鼠体重。(3)攻毒第3天和第6天分别取各组小鼠的肺脏组织,进行脏器滴定。实验结果:1.拯救了一株B型流感病毒B/Yamagata/16/88株,拯救的病毒株命名为B-S9。PCR鉴定显示和B型流感病毒各基因片段大小一致;B-S9进行RT-PCR测序后,经过比对,其序列和Genbank上公布的一致;电镜下观察到流感病毒粒子。B-S9在SPF级鸡胚和MDCK细胞上病毒的毒力分别为108.75 EID50/ml和107.5 TCID50/ml,并测定其在MDCK细胞的生长曲线。2.攻毒剂量105EID50组和106EID50组小鼠体重明显下降,对照组小鼠体重缓慢上升,不同攻击剂量组的小鼠生存率均为100%。在14d观察期内,小鼠未出现死亡情况,所以其MLD50106.5 EID50。B-S9仅在肺脏和鼻甲骨中复制,其他组织未检测到病毒。感染小鼠的肺脏病毒滴定结果表明病毒株B-S9的复制高峰在第3天,第6天时病毒的滴度下降。3.小鼠免疫实验中,以拯救病毒株B-S9为抗原,中和抗体检测结果表明滴鼻免疫比肌注免疫的中和抗体效价高,小鼠血清中的血凝抑制抗体检测结果是滴鼻组高于肌注组。用2013-2014候选疫苗株NYMC BX-51B进行HI检测,显示两组小鼠血清中也有该病毒的HI抗体,但是效价较低。4.免疫小鼠经亲本株B-S9攻毒后,对照组体重下降明显,滴鼻组未有明显下降,肌注组有小幅下降。滴鼻组小鼠肺脏未有病毒复制,肌注组小鼠肺脏仅在第3天检测到病毒复制,对照组小鼠有高水平复制。免疫小鼠经2013-2014候选疫苗株NYMC BX-51B攻毒后,滴鼻组、肌注组小鼠体重变化不大,对照组小鼠体重小幅下降。滴鼻免疫小鼠肺脏没有检测到病毒的复制,肌注组小鼠肺脏病毒复制第3天要高