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鸡、鸭源性DNA标准物质研制及在肉制品源性成分定量检测中的应用

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鸡、鸭源性DNA标准物质研制及在肉制品源性成分定量检测中的应用

作者：姜展樾四川农业大学

学位级别：硕士

动物源性成分检测对于食品安全、进出口贸易、清真食品认可、动物疫病防治等具有重要意义,标准物质的缺失,严重影响检测结果的可靠性、溯源性、互认性。核酸作为遗传信息的载体,具有结构稳定、保存期长、特异性良好等特点,是制备标准物... 详细信息

动物源性成分检测对于食品安全、进出口贸易、清真食品认可、动物疫病防治等具有重要意义,标准物质的缺失,严重影响检测结果的可靠性、溯源性、互认性。核酸作为遗传信息的载体,具有结构稳定、保存期长、特异性良好等特点,是制备标准物质的理想材料。本文基于线粒体DNA高度保守序列,研制鸡源性ND1基因和鸭源性cytb基因DNA标准物质,建立一种基于标准物质和PCR法的鸡、鸭源性成分定量检测方法,实现鸡、鸭源性成分的定量检测。研究结果如下:1.采用真空冷冻干燥法制备干粉质控样品,用CTAB-氯仿法一次性提取大量DNA,并对提取产物的浓度、纯度、特异性、交叉污染等进行验证,结果表明,提取产物符合标准物质候选物相关要求。2.筛选鸡源性、鸭源性基因特异性高度保守序列,并选用国家标准GB/T 38164-2019《常见畜禽动物源性检测实时荧光PCR法》中的序列,对序列进行验证,建立、优化ddPCR反应体系,并确定检出限。建立的ddPCR检测方法对鸡、鸭源性的最低定量限分别为4.60 copies/μL、0.28 copies/μL,线性相关系数R均大于0.99;方法重复性和方法复现性RSD分别小于1.0%和1.5%。3.用优化后的ddPCR法对标准物质候选物的均匀性、稳定性等进行评价,并联合八家具备相关资质的实验室对标准物质候选物进行定值,确定了鸡源性ND1基因DNA标准物质和鸭源性cytb基因DNA标准物质的特性量值-基因拷贝数分别为6.62×10 copies/μL、3.15×10 copies/μL,扩展不确定度分别为2.88×10 copies/μL、1.09×10 copies/μL。制备的两种DNA标准物质均匀性良好,可在-20℃稳定放置6个月。4.基于研制的标准物质,用ddPCR和qPCR方法,以拷贝数浓度为中间值,建立鸡、鸭源性成分定量检测方法,用模拟样品进行验证,绝对误差小于±10.0%。检测95批次市售样品,其中鸡源性成分检出率为22.1%,鸭源性成分检出率为21.1%。

关键词： DNA标准物质 qPCR ddPCR 动物源性成分定量检测

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聚合酶链反应分析仪计量测试技术探讨

中国测试 2020年第10期46卷 98-102页

作者：蒋子敬周李华马丽侠叶德萍姜展樾中国测试技术研究院四川成都610021

聚合酶链反应分析仪(PCR仪)在生命科学研究、临床检验、食品检验、司法鉴定等多个领域有着广泛的应用。PCR仪器计量特性与测试结果直接相关,有助于计量测试技术的研究,能够确保测量结果的准确可靠,维护良好的仪器工作状态,同时符合相关... 详细信息

聚合酶链反应分析仪(PCR仪)在生命科学研究、临床检验、食品检验、司法鉴定等多个领域有着广泛的应用。PCR仪器计量特性与测试结果直接相关,有助于计量测试技术的研究,能够确保测量结果的准确可靠,维护良好的仪器工作状态,同时符合相关实验室认可的要求。该文对市面上几种类型的PCR仪的关键计量特性参数的测试方法、检测设备、标准物质等进行探讨,为PCR仪的计量检测与校准工作提供参考和依据。

关键词： PCR仪计量测试标准物质

4种致泻大肠埃希氏菌数字PCR检测方法的建立

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食品科技 2022年第9期47卷 290-296页

作者：马丽侠周李华叶德萍蒋子敬姜展樾易艳中国测试技术研究院生物研究所四川成都610021 四川农业大学食品学院四川雅安625000

针对常见致泻大肠埃希氏菌特征基因stx2、escV、lt、pic,研究建立了一套微滴数字PCR(ddPCR)方法。优化了引物探针浓度,退火温度等条件,考察了方法特异性、线性范围、精密度。结果表明,特征基因stx2在2.0~24506.67个拷贝,escV在8.8~24756... 详细信息

针对常见致泻大肠埃希氏菌特征基因stx2、escV、lt、pic,研究建立了一套微滴数字PCR(ddPCR)方法。优化了引物探针浓度,退火温度等条件,考察了方法特异性、线性范围、精密度。结果表明,特征基因stx2在2.0~24506.67个拷贝,escV在8.8~24756.67个拷贝,lt在1.63~19990.00个拷贝,pic在1.63~26500.00个拷贝均呈线性关系,线性系数均大于0.99;确定了各基因的定量限(stx2、escV、lt、pic分别为21个拷贝、20.60个拷贝、21.67个拷贝、27.67个拷贝);方法精密度小于10%,特异性良好。采用该方法对实际样品进行检测,结果显示,加标样品显示有阳性微滴,而其余样品均未检出阳性微滴,表明建立的数字PCR方法可用于食品中致泻大肠埃希氏菌的检测。该方法可为监管部门对生产牛肉制品、即食生肉制品、生食果蔬制品等重点企业生产环境卫生的检查提供技术支撑,有利于提高我国食品生产中原料、环境及加工过程的卫生水平,防止微生物污染和交叉污染,为食品生产全链条进行食品安全风险防范提供有力保障。

关键词：大肠埃希氏菌致泻大肠埃希氏菌质粒DNA 微滴数字PCR

基于分子生物学原理技术检测肉制品中动物源性成分研究进展

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食品与发酵工业 2023年第4期49卷 288-294页

作者：易艳刘明东蒋子敬姜展樾马丽侠叶德萍韩国全周李华四川农业大学食品学院四川雅安625000 中国测试技术研究院四川成都610000

肉制品掺假严重侵害消费者对食品质量安全的信任,影响食品行业的健康发展,已成为全球关注的焦点之一。该文综述当前应用较为广泛的基于分子生物学原理的检测技术的优缺点和应用场景,包括普通PCR定性检测、实时荧光PCR相对定量、数字PCR... 详细信息

肉制品掺假严重侵害消费者对食品质量安全的信任,影响食品行业的健康发展,已成为全球关注的焦点之一。该文综述当前应用较为广泛的基于分子生物学原理的检测技术的优缺点和应用场景,包括普通PCR定性检测、实时荧光PCR相对定量、数字PCR绝对定量、环介导等温扩增快速检测、DNA条形码、高通量测序等新型分子检测技术,以期为政府监管部门及第三方检测机构的研究者提供参考。

关键词：肉制品掺假动物源性成分分子生物学技术高通量测序 PCR

转基因玉米MON863质粒DNA双重数字PCR定值方法的建立

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中国测试 2020年第10期46卷 28-36页

作者：马丽侠周李华蒋子敬姜展樾叶德萍蒲春如杜娟兰中国测试技术研究院四川成都610021 四川农业大学食品学院四川雅安625000

针对转基因玉米MON863质粒DNA,研究建立一套双重数字PCR(ddPCR)定值方法。优化引物探针浓度,退火温度等条件,考察方法特异性、线性范围、精密度。结果表明,外源基因MON863在1.6~6743.3 copies和内源基因Adh在1.1~6770.0 copies的浓度范... 详细信息

针对转基因玉米MON863质粒DNA,研究建立一套双重数字PCR(ddPCR)定值方法。优化引物探针浓度,退火温度等条件,考察方法特异性、线性范围、精密度。结果表明,外源基因MON863在1.6~6743.3 copies和内源基因Adh在1.1~6770.0 copies的浓度范围均呈线性关系,r^2为1;MON863基因和Adh基因的定量限分别为8.3 copies和7.9 copies;方法精密度小于5%。采用该方法对基体标准物质进行验证,误差小于10%。该方法每个反应体系都含有内源(VIC)和外源(FAM)基因,能实现内外源基因的同时检测,避免同一样品在不同反应体系造成的定值差异。结果显示该方法与单重数字PCR定值结果无显著差异,重复性优于单重数字PCR结果,方法准确可靠。

关键词：转基因玉米质粒DNA 微滴数字PCR 双重数字PCR

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核酸提取用磁珠粒度快速测试方法

中国测试 2023年第11期49卷 184-188页

作者：侯晓妮吕帅姜展樾马丽侠刘明东周李华中国测试技术研究院生物研究所四川成都610023 四川天府新区林业园林管理所四川成都610213

为快速、准确地对核酸提取用磁珠的粒度进行测试,研究使用激光衍射粒度分析技术进行粒度试验,考察搅拌速度、超声频率、样品浓度(遮光度)的影响,并采用扫描电子显微镜进行方法准确度的确认,进行耐用性、时间稳定性、重复性、中间精密度... 详细信息

为快速、准确地对核酸提取用磁珠的粒度进行测试,研究使用激光衍射粒度分析技术进行粒度试验,考察搅拌速度、超声频率、样品浓度(遮光度)的影响,并采用扫描电子显微镜进行方法准确度的确认,进行耐用性、时间稳定性、重复性、中间精密度的验证。同时,选取不同粒度的实际样品进行测定,结果表明,该方法的重复性优于3%,中间精密度优于5%。由此可见,该方法准确、可靠、快速、便捷,适用于核酸提取用磁珠粒度和粒度分布的测试。

关键词：磁珠粒度激光衍射法测试

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加工肉制品自动化DNA提取体系建立及其验证

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食品科技 2021年第8期46卷 104-110页

作者：姜展樾乔倩陈鹏马丽侠蒋子敬叶德萍周李华韩国全中国测试技术研究院四川成都610021 四川农业大学食品学院四川雅安625000

针对加工肉制品中DNA提取难度大、干扰杂质多、难以实现自动化、不能满足高通量的核酸检测需求等问题,研究建立了一种适用于加工肉制品的高通量、自动化的DNA提取方法。该方法采用实验室设计优化磁珠并对体系关键组分进行优化,考察了方... 详细信息

针对加工肉制品中DNA提取难度大、干扰杂质多、难以实现自动化、不能满足高通量的核酸检测需求等问题,研究建立了一种适用于加工肉制品的高通量、自动化的DNA提取方法。该方法采用实验室设计优化磁珠并对体系关键组分进行优化,考察了方法适用性和重复性,与国内外典型厂商的5种试剂盒比对,再联合8家实验室验证了其对39种加工肉制品的提取效果。结果表明,此方法提取的加工肉制品DNA浓度高、纯度好,适用于动物组织及加工肉制品手动和自动化提取,实际样品检出率为100%。该方法重复性好,适用于不同种类动物组织及加工肉制品自动化、高通量的DNA提取,产物满足荧光定量PCR检测、二代测序等下游试验要求,为食品掺假的分子鉴别提供技术支撑。

关键词：磁珠法 DNA提取实时荧光PCR 加工肉制品自动化

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玉米MON863质粒DNA标准物质的研制

化学试剂 2021年第12期43卷 1729-1734页

作者：马丽侠周李华叶德萍蒋子敬姜展樾蒲春如杜娟兰韩国全中国测试技术研究院生物研究所四川成都610021 四川农业大学食品学院四川雅安625000

转基因成分检测是转基因生物安全应用和管理的重要技术支撑,转基因标准物质种类的不足可影响转基因生物检测方法的建立和标准化。选取玉米MON863中外源基因MON863与内标基因Adh1构建质粒标准物质,通过测序验证,以双重数字PCR技术对获得... 详细信息

转基因成分检测是转基因生物安全应用和管理的重要技术支撑,转基因标准物质种类的不足可影响转基因生物检测方法的建立和标准化。选取玉米MON863中外源基因MON863与内标基因Adh1构建质粒标准物质,通过测序验证,以双重数字PCR技术对获得的质粒DNA进行均匀性及不同温度下(-20、4、25、37℃)短期(14 d)和-20℃长期(6个月)稳定性检验,联合8家实验室进行定值分析。结果显示,玉米MON863质粒DNA标准物质具备良好的均匀性,可以在-20℃稳定存放6个月;外源与内标基因的拷贝数比值为1.01,扩展不确定度为0.04;拷贝数为5.78×10^(10) copies/μL,扩展不确定度为0.29×10^(10) copies/μL。获得的标准物质适用于玉米MON863的方法学建立、定性定量检测和实验室质控等应用。

关键词：质粒DNA 标准物质数字PCR 双重数字PCR 转基因玉米

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生化检测领域细胞相关标准体系初探

中国标准化 2020年第S1期 259-264页

作者：周李华李怀平姜展樾叶德萍蒋子敬马丽侠中国测试技术研究院

随着细胞技术的创新与突破,细胞研究得到迅猛发展,细胞治疗作为一种新兴的治疗手段,在临床医学发挥着重要作用。本文从细胞发展背景、现有相关依据、细胞标准体系结构、发展建议几个方面进行了初探,从法律法规、基础标准、专用标准3个... 详细信息

随着细胞技术的创新与突破,细胞研究得到迅猛发展,细胞治疗作为一种新兴的治疗手段,在临床医学发挥着重要作用。本文从细胞发展背景、现有相关依据、细胞标准体系结构、发展建议几个方面进行了初探,从法律法规、基础标准、专用标准3个层面简单探讨了细胞体系框架建立的基本思路和原则,着重在产品实现标准子体系模块进行了相关说明,以对细胞相关标准系统建设提供参考。

关键词：生化检测细胞治疗标准标准体系