鸡、鸭源性DNA标准物质研制及在肉制品源性成分定量检测中的应用

作     者：姜展樾 

作者单位：四川农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：韩国全;周李华

授予年度：2023年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083203[工学-农产品加工及贮藏工程] 

主      题：DNA标准物质 qPCR ddPCR 动物源性成分 定量检测 

摘      要：动物源性成分检测对于食品安全、进出口贸易、清真食品认可、动物疫病防治等具有重要意义,标准物质的缺失,严重影响检测结果的可靠性、溯源性、互认性。核酸作为遗传信息的载体,具有结构稳定、保存期长、特异性良好等特点,是制备标准物质的理想材料。本文基于线粒体DNA高度保守序列,研制鸡源性ND1基因和鸭源性cytb基因DNA标准物质,建立一种基于标准物质和PCR法的鸡、鸭源性成分定量检测方法,实现鸡、鸭源性成分的定量检测。研究结果如下:1.采用真空冷冻干燥法制备干粉质控样品,用CTAB-氯仿法一次性提取大量DNA,并对提取产物的浓度、纯度、特异性、交叉污染等进行验证,结果表明,提取产物符合标准物质候选物相关要求。2.筛选鸡源性、鸭源性基因特异性高度保守序列,并选用国家标准GB/T 38164-2019《常见畜禽动物源性检测实时荧光PCR法》中的序列,对序列进行验证,建立、优化ddPCR反应体系,并确定检出限。建立的ddPCR检测方法对鸡、鸭源性的最低定量限分别为4.60 copies/μL、0.28 copies/μL,线性相关系数R均大于0.99;方法重复性和方法复现性RSD分别小于1.0%和1.5%。3.用优化后的ddPCR法对标准物质候选物的均匀性、稳定性等进行评价,并联合八家具备相关资质的实验室对标准物质候选物进行定值,确定了鸡源性ND1基因DNA标准物质和鸭源性cytb基因DNA标准物质的特性量值-基因拷贝数分别为6.62×10 copies/μL、3.15×10 copies/μL,扩展不确定度分别为2.88×10 copies/μL、1.09×10 copies/μL。制备的两种DNA标准物质均匀性良好,可在-20℃稳定放置6个月。4.基于研制的标准物质,用ddPCR和qPCR方法,以拷贝数浓度为中间值,建立鸡、鸭源性成分定量检测方法,用模拟样品进行验证,绝对误差小于±10.0%。检测95批次市售样品,其中鸡源性成分检出率为22.1%,鸭源性成分检出率为21.1%。