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猪丁型冠状病毒NSP14蛋白截短表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立

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南方农业学报 2024年第4期55卷 1238-1248页

作者：刘思雨何颖卢冰霞赵武赵硕许心婷全琛宇秦毅斌欧阳康广西大学动物科学技术学院/广西高校动物疫病预防与控制重点实验室/广西兽用生物制品工程研究中心广西南宁530004 广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室/农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室广西南宁530001

【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDC... 详细信息

【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDCoV 1468B毒株为模板,构建NSP14截短基因原核重组质粒pET32a-NSP14,经双酶切和测序鉴定后,通过原核表达系统获得NSP14融合蛋白,将其纯化后免疫新西兰大白兔获得NSP14蛋白的多克隆抗体,进行Western blotting验证,并用间接ELISA测定其效价。以NSP14融合蛋白为抗原包被酶标板,采用方阵滴定法优化一系列反应条件,构建检测PDCoV抗体的间接ELISA。【结果】在构建的pET32a-NSP14重组质粒中,NSP14蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,其大小约40.2 kD;制备的NSP14蛋白多克隆抗体效价在1∶512000以上,经Western blotting验证,能与纯化的NSP14融合蛋白发生特异性反应。经过筛选,确定所构建检测PDCoV抗体间接ELISA的最佳反应条件:NSP14融合蛋白最佳包被浓度为4.0μg/mL,包被条件为37℃、2.0 h;封闭条件为5%脱脂奶粉封闭1.0 h;待检血清按1∶400稀释,孵育2.0 h;酶标二抗1∶2500稀释,孵育60.0 min;TMB底物显色时间为30.0 min。特异性试验结果表明,猪病阳性血清PRRSV、JEV、PCV2、PPV、PEDV和CSFV的OD450均小于0.235,说明优化的间接ELISA检测的病原与其他猪病毒阳性血清无反应,特异性良好。重复性试验结果表明,优化的间接ELISA检测猪病阳性血清的批内和批间变异系数均小于10.000%,说明优化的ELISA具有较好的重复性。【结论】成功制备具有高效价和良好免疫反应性的PDCoV NSP14蛋白多克隆抗体,并建立检测该抗体的特异性、敏感性和重复性良好的间接ELISA,可供进一步研究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断参考应用。

关键词：猪丁型冠状病毒 NSP14蛋白原核表达多克隆抗体制备间接ELISA

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香菇多糖对蛋鸡生长性能、免疫功能及禽流感疫苗免疫效果的影响

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中国饲料 2024年第10期 63-67页

作者：莫文湛刘磊顾祖华钟强何宏勇熊飚梁礼南邓森松陈国活卢冰霞广西农业职业技术大学广西南宁530007 广西农贝贝农牧科技有限公司广西玉林537000 玉林市动物疾病预防控制中心广西玉林537006 广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室广西南宁530001

为掌握香菇多糖对蛋鸡生长性能、免疫功能及禽流感疫苗免疫效果的影响,试验将120只1日龄禽流感非免疫罗曼灰蛋鸡随机分为4组,对照组不添加香菇多糖,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别添加50、100、200 mg/kg香菇多糖进行试验,试验为期77 d。结果显示... 详细信息

为掌握香菇多糖对蛋鸡生长性能、免疫功能及禽流感疫苗免疫效果的影响,试验将120只1日龄禽流感非免疫罗曼灰蛋鸡随机分为4组,对照组不添加香菇多糖,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别添加50、100、200 mg/kg香菇多糖进行试验,试验为期77 d。结果显示,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ平均日增重显著高于对照组(P<0.05),料重比显著低于对照组(P<0.05),Ⅲ组最佳;Ⅲ组蛋鸡血清中IL-2和IFN-γ水平显著高于对照组(P<0.05);禽流感疫苗免疫后,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组蛋鸡禽流感H5抗体水平均显著高于对照组(P<0.05),Ⅲ组抗体水平最高。结果表明,香菇多糖可以提高蛋鸡生长性能、免疫功能及禽流感疫苗免疫效果,在本试验条件下,香菇多糖的最佳添加量为200 mg/kg。

关键词：香菇多糖蛋鸡生长性能免疫功能禽流感疫苗免疫

猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用

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动物医学进展 2024年第2期45卷 11-16页

作者：周颖赵硕覃国喜梁龙华肖婷陈忠伟卢冰霞秦毅斌林昌华张胜斌段群棚胡庭俊何颖广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 广西壮族自治区兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室/农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室广西南宁530001 广西农垦永新畜牧集团金光公司广西南宁530042 广西农垦永新畜牧集团西江公司广西贵港537100

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感... 详细信息

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10^(3)~10^(4)倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。

关键词：猪肺炎支原体猪鼻支原体 TaqMan荧光定量PCR

广西猪JEV FC792分离株全基因序列的测定与分析及RT-LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达

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广西猪JEV FC792分离株全基因序列的测定与分析及RT-LAMP的建立与...

作者：卢冰霞广西大学

学位级别：硕士

流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的一种十分重要的人畜共患的急性传染病,其主要流行于亚洲的东部和东南部以及澳大利亚等地区,其引起的死亡率可达20%以上根据世界卫... 详细信息

流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的一种十分重要的人畜共患的急性传染病,其主要流行于亚洲的东部和东南部以及澳大利亚等地区,其引起的死亡率可达20%以上根据世界卫生组织的统计,乙脑年发病人数已达35000例,其中中国的发病人数占到了80%。JEV可感染猪,引起妊娠母猪流产、公猪睾丸肿大和仔猪神经系统疾病,给养猪业造成了巨大的损失。猪是JEV主要的储存和扩散宿主,因此对猪感染乙脑的诊断与防制具有重要的公共卫生学意义。首先,本研究以JEV SA14为模板设计JEV特异性引物,分7段扩增JEV广西分离株FC792全基因,经序列测定与拼接后得到FC792分离株全基因组序列。FC792株全长10977个核苷酸,其中5’非编码区有95个核苷酸,3’非编码区有586个核苷酸,开放阅读框含10296个核苷酸,共编码3432个氨基酸。核苷酸与氨基酸同源性分析发现FC792株与国内外JEV代表毒株的核苷酸同源性为84.6%-99.7%,氨基酸同源性为96.2%-99.4%。其中与SA14-14-2和YUNNAN0901株核苷酸同源性分别为99.7%和99.6%,氨基酸同源性分别为99.4%和99.2%。遗传进化分析表明FC792株属于基因Ⅲ型,且与YUNNAN0901和SA14-14-2株的遗传进化关系最为接近。FC792株与YUNNAN0901株核苷酸的差异率仅为0.45%,氨基酸差异率为0.76%,结构蛋白含有5个氨基酸的差异。其次,本研究建立了JEV RT-LAMP检测方法,并进行了反应体系和反应条件的优化,灵敏度实验表明本研究建立的JEV RT-LAMP检测方法的检测极限为0.5pg,特异性实验证明其具有较高的特异性。与RT-Nested-PCR比较,两种方法检出率的符合率为90.9%。而且反应结束后可以通过添加化学发光剂进行可视化观察,大大缩短了检测时间。第三,克隆出JEV FC792株包含E基因抗原域Ⅰ和抗原域Ⅱ的基因片段Ea,成功构建出原核表达质粒pET-32a-Ea。用JEV阳性猪血清作为一抗进行Western-blot分析,初步表明重组蛋白Ea具有抗原性,纯化复性重组蛋白Ea,免疫小鼠2次,间隔1周,二免一周后眼球采血、分离血清,经包被JEV全病毒的ELISA试剂盒检测为阳性,说明Ea具有抗原性;ELSIA检测为阳性的小鼠血清进行病毒的中和试验结果表明免疫组小鼠血清具有中和JEV的能力,中和抗体效价为1：70,说明E。具有较好的免疫原性。

关键词：乙型脑炎 RT-LAMP 全基因组序列测定与分析E基因免疫原性

猪德尔塔冠状病毒N蛋白单克隆抗体2D7的制备与生物学特性鉴定

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中国动物传染病学报 2022年

作者：张宁赵平刘思雨赵硕陈忠伟何颖欧阳康卢冰霞蒋家霞郭旋林昌华赵武黄伟坚秦毅斌赵凌广西职业技术学院广西桂垦牧业有限公司广西大学动物科学技术学院广西壮族自治区兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室/农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室华中农业大学农业微生物学国家重点实验室广西农垦永新畜牧集团西江有限公司广西农垦永新畜牧集团金光有限公司

为获得猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody，McAb)，本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因，构建表达质粒，转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌，诱导表达后获得PDCoV-N... 详细信息

为获得猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody，McAb)，本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因，构建表达质粒，转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌，诱导表达后获得PDCoV-N重组蛋白，将其进行纯化后再免疫小鼠，制备针对PDCoV-N蛋白的McAb，并进行了抗体的效价测定、免疫荧光(IFA)、Western blotting、亚类的鉴定、McAb特异性的鉴定。结果，成功构建pCold II-PDCoV-N重组原核表达质粒，SDS-PAGE显示重组N蛋白成功表达，分子质量约为38 kDa；经小鼠免疫、细胞融合、亚克隆筛选获得一株分泌PDCoV-N蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞株；制备的腹水经间接ELISA方法测定抗体的效价为2.048×10。IFA、Western blotting试验表明该McAb可以与PDCoV-N蛋白及全病毒特异性结合，亚类鉴定其亚型为IgG1，轻链为κ链。该McAb只与PDCoV反应，而与其它猪肠道病毒无交叉反应，表明本研究制备的McAb具有良好的特异性。本研究成功制备了PDCoV-N蛋白的McAb，为进一步研究PDCoV的生物学特性和诊断试剂的开发提供技术支持。

关键词：猪德尔塔冠状病毒 N蛋白单克隆抗体

猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

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中国兽医科学 2022年第11期52卷 1373-1378页

作者：秦秋英速雪丽黄诗婷秦毅斌何颖卢冰霞陈樱韦祖樟黄伟坚欧阳康广西大学动物科学技术学院动物传染病与分子免疫学实验室广西南宁530005 广西壮族自治区兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室广西南宁530005

针对猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的N基因建立检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,并验证了其特异性、敏感性和重复性等。结果显示,本方法特异性高,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪肠病毒、伪狂犬病病毒、猪... 详细信息

针对猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的N基因建立检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,并验证了其特异性、敏感性和重复性等。结果显示,本方法特异性高,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪肠病毒、伪狂犬病病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪星状病毒等病原无交叉反应。本方法C_(t)值与标准模板浓度在10^(8.5)~10^(3.5)PFU/mL范围内呈良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9949,直线方程为y=-3.5949x+41.006,最低检测限为10^(2.50)PFU/mL。运用该方法检测PDCoV感染不同来源细胞系的病毒载量,发现的PDCoV感染宿主谱广,能感染不同来源的细胞,且在LLC-PK细胞上的复制能力最强。本研究建立的方法为PDCoV的防控提供了技术支持。

关键词：猪德尔塔冠状病毒 N基因荧光定量PCR LLC-PK细胞

ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

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中国兽医科学 2023年第6期53卷 671-678页

作者：赵硕陈忠伟肖婷何颖张宁覃国喜卢冰霞段振华秦毅斌张胜斌段群棚赵武韦明宇广西壮族自治区兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室广西南宁530001 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070 广西农垦永新畜牧集团金光有限公司广西南宁530042 玉林市动物疫病预防控制中心广西玉林537000 广西农垦永新畜牧集团西江有限公司广西贵港537100 广西农垦永新畜牧集团有限公司广西南宁530022

为了建立一种可同时精准、快捷鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,本研究选择猪源β-actin为内参基因,根据ASFV的P72基因及PRRSV的ORF6基因设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了ASFV和PR... 详细信息

为了建立一种可同时精准、快捷鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,本研究选择猪源β-actin为内参基因,根据ASFV的P72基因及PRRSV的ORF6基因设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证,并初步应用于临床样品的检测。结果显示,该方法可在45 min内完成对ASFV、PRRSV及猪源β-actin基因的特异性扩增;对ASFV、PRRSV及猪源β-actin标准品模板的最低检测拷贝数分别为7.87×101 copies/μL、1.19×102 copies/μL和5.99×103 copies/μL,同一模板的3次重复试验的组内及组间变异系数均小于2%;用该方法检测92份临床样品,未检出ASFV,检出19份PRRSV阳性样品。结果表明,本研究建立了一种可快速鉴别检测ASFV及PRRSV的多重荧光定量PCR方法,较普通PCR敏感性高103倍,可应用于ASFV和PRRSV的快速鉴别诊断及流行病学调查。

关键词：非洲猪瘟病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒多重TaqMan荧光定量PCR

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猪星状病毒ORF2基因的克隆及序列分析

中国兽医杂志 2012年第12期48卷 27-31,I0001页

作者：兰家暖刘磊郭旋刘欢卢冰霞张民秀廖承球黄伟坚广西大学动物科学技术学院广西南宁530005 广西柯新源(集团)原种猪有限责任公司广西南宁530001 广东温氏食品集团有限公司广东云浮527439

参考GenBank上发表的猪星状病毒亚基因组序列,设计1对引物,对猪星状病毒广西流行株衣壳蛋白ORF2基因进行扩增,最终克隆得到PAstV/NNJG7株的衣壳蛋白完整序列。序列分析发现,其ORF2全长2 358bp,编码786个氨基酸;与猪星状病毒Ⅰ型参考株... 详细信息

参考GenBank上发表的猪星状病毒亚基因组序列,设计1对引物,对猪星状病毒广西流行株衣壳蛋白ORF2基因进行扩增,最终克隆得到PAstV/NNJG7株的衣壳蛋白完整序列。序列分析发现,其ORF2全长2 358bp,编码786个氨基酸;与猪星状病毒Ⅰ型参考株核苷酸同源性最高,为77.3%～79.4%;在ORF1b和ORF2连接处有一段高度保守的序列,在ORF2 3′端有一段长83bp非翻译序列及一个含43bp高度保守的茎环样基序。本试验不仅丰富了猪星状病毒衣壳蛋白基因序列,也为基因疫苗和诊断试剂盒的研制提供材料及理论依据。

关键词：猪星状病毒 ORF2基因基因克隆序列分析

猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

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中国动物传染病学报 2022年第5期30卷 74-82页

作者：秦毅斌刘磊卢冰霞段群棚何颖陈忠伟周英宁李斌赵硕梁家幸苏乾莲蒋冬福赵武广西兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室南宁530001 广西农业职业技术学院南宁530007 广西大学南宁530005

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清学ELISA抗体检测方法,本研究以原核表达纯化的PEDV S2重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PEDV重组S2蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,重组蛋白抗原最佳包被量0.8μg/孔;血清最佳... 详细信息

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清学ELISA抗体检测方法,本研究以原核表达纯化的PEDV S2重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PEDV重组S2蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,重组蛋白抗原最佳包被量0.8μg/孔;血清最佳稀释倍数为1∶40,最佳血清孵育时间为120 min;酶标二抗最佳工作浓度为1∶4000,最佳二抗反应时间为45 min;最佳底物显色时间为15 min;待检血清样品S/P值>0.212时判定为阳性,待检血清样品S/P值<0.188时判定为阴性,当0.188≤待检血清样品S/P值≤0.212时判定为可疑。以S2蛋白作为包被抗原建立的PEDV抗体间接ELISA方法仅对PEDV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪丁型冠状病毒等主要猪源病毒阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。该方法检测灵敏度较高、重复性好,批内和批间重复性变异系数均小于10%。利用本研究建立的PEDV S2蛋白间接ELISA抗体检测方法对广西地区不同阶段猪群血清样品共计622份进行检测,总体样品阳性率为76.05%,不同阶段阳性率相差较大。本实验建立的ELISA方法可应用于临床样品PEDV抗体检测以及PEDV血清流行病学调查。

关键词：猪流行性腹泻病毒 S2基因 ELISA