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连翘叶和种子中活性成分绿色高效提取分离方法研究

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连翘叶和种子中活性成分绿色高效提取分离方法研究

作者：刘德凤山东农业大学

学位级别：硕士

醛固酮-WNK4参与盐负荷对远端肾小管钠离子转运体表达的调节

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醛固酮-WNK4参与盐负荷对远端肾小管钠离子转运体表达的调节

作者：刘德凤复旦大学

学位级别：硕士

第一部分WNK4参与盐负荷对肾脏远端钠离子转运体的调节背景高血压及其并发症是威胁人类健康的重要疾病。其中容量代谢在高血压的发病机制中具有重要意义,而肾脏是机体调节水盐代谢的重要器官。肾脏通过肾小球的滤过及肾小管的重吸收来... 详细信息

第一部分WNK4参与盐负荷对肾脏远端钠离子转运体的调节背景高血压及其并发症是威胁人类健康的重要疾病。其中容量代谢在高血压的发病机制中具有重要意义,而肾脏是机体调节水盐代谢的重要器官。肾脏通过肾小球的滤过及肾小管的重吸收来调节机体的容量代谢,存在于肾脏远曲小管的钠氯协同转运子(Na-Cl cotransporter)简称NCC和位于集合管的上皮细胞钠通道(epithelial sodium channel)简称ENaC是肾脏在此段重吸收的主要方式,在生理条件下Na离子在远端肾单位的重吸收仅占滤过液的5%-10%,但是已构成肾钠重吸收的限速部位。由于γ亚基对ENaC的膜定位非常重要,因此yENaC结构和功能的改变可以直接影响血钠的浓度,肾脏远端小管对钠的重吸收依赖于进入远曲小管的氯化钠负荷。长期氯化钠高负荷可引起远端小管细胞超微结构改变,例如DCT细胞肥大,基底膜面积增加,线粒体增大等同时增强远端小管氯化钠共转运蛋白的能力。关于水盐代谢的调节以往了解最多的是醛固酮,早有学者发现醛固酮可以上调NCC及ENaC在肾脏的表达,而近年来人们在研究PHAⅡ(假性低醛固酮血症)的发病过程中发现了一个新的激酶家族With No lysine Kinase简称WNK激酶家族,其中的WNK1和WNK4的基因突变是PHAⅡ的发病原因。研究发现WNK4在体外可以抑制NCC和ENaC在细胞膜的表达,因此本部分研究的主要目的是体内观察WNK4是否参与盐负荷对肾脏远端钠离子转运体表达的调节。方法将SD大鼠分为3组：(1)高盐组(H,4%NaCl)(2)正常盐组(N,0.4%NaCl)(3)低盐组(L,0.07%NaCl),所有大鼠自由饮水,喂养2周。动物成模前后检测尾动脉血压,用代谢笼收集24小时尿量检测尿中主要离子的浓度。血生化学检测血肌酐、白蛋白、血电解质等的浓度。用放免方法检测血浆醛固酮的变化。应用Real-timePCR和Western-blot方法检测大鼠肾脏WNK4、NCC、γENaC、和AQP-2的1nRNA和蛋白的变化。结果各组大鼠成模后血压、血肌酐、白蛋白、血钠、血钾都在正常范围,与成模前没有明显的变化。高盐组大鼠尿量比成模前有了显著的增多,同时尿中排泄的钠离子有了显著的增多。低盐组大鼠尿中排泄的钠离子有了显著的减少,同时尿中排泄钾离子有了增多。Westernblot和免疫组化显示：AQP-2在高盐组比正常盐组有了增多,在低盐组比正常盐组有了减少。这些都说明盐饮食的动物模型是成功的。符合生理条件下机体对盐的调节。高盐组血浆醛固酮比正常盐组有了显著的减少,低盐组血浆醛固酮比正常盐组有了显著的增多。Real-timePCR和Westernblot显示低盐组大鼠肾脏WNK4的表达比正常盐组有了减少,而高盐组有了增多。低盐组大鼠肾脏NCC和yENaC的表达比正常盐组有了显著的增多,而高盐组有了减少。结论控制饮食中的盐可以作为良好的生理条件下的盐饮食模型。饮食中的盐可以调节大鼠肾脏NCC和yENaC的表达。醛固酮和WNK4都参与了这一生理调节过程。第二部分醛固酮对WNK4的负调节作用背景研究发现WNK4在体外可以抑制NCC和ENaC在细胞膜的表达。同时我们的体内研究发现：醛固酮和WNK4都可以影响NCC及ENaC在细胞膜的表达,但是他们之间存在什么联系尚不清楚。有文献提示,WNK4可被(serum-and glucose-regulated kinase)SGK1磷酸化,其作用的发挥有赖于SGK1的活性,而SGKl是一个醛固酮重要的诱导蛋白,参与调节ENaC在细胞膜的表达。因此本部分研究目的在于通过建立生理条件下的盐饮食大鼠模型,同时观察醛固酮和WNK4对NCC及ENaC的影响,探讨生理状态下WNK4与醛固酮之间的可能关系。并进一步探讨他们对NCC的调节机制。方法将SD大鼠分为5组：(1)高盐组(H,4%NaCl)(2)正常盐组(N,0.4%NaCl)(3)低盐组(L,0.07%NaCl)(4)高盐加醛固酮组(H+A,4%NaCl+1mg／kg／天醛固酮)(5)低盐加安体舒通(L+S,0.07% NaCl+0.1g／kg／天安体舒通),所有大鼠自由饮水,喂养2周。动物成模前后检测尾动脉血压,用代谢笼收集24小时尿量检测尿中主要离子的浓度。血生化学检测血肌酐、白蛋白、血中主要离子浓度。用放免方法检测血浆醛固酮的变化。应用Real-timePCR和Western-blot方法检测大鼠肾脏NCC,yENaC和WNK4的mRNA和蛋白的变化。用蔗糖密度梯度离心法观察NCC在细胞内的分布变化。结

关键词：盐饮食醛固酮钠氯协同转运体上皮细胞钠通道 WNK4 盐饮食醛固酮钠氯协同转运体上皮钠通道 WNK4 钠氯协同转运体糖基化 WNK4

比较不同免疫抑制剂联合糖皮质激素治疗特发性膜性肾病的感染风险：网状meta分析

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比较不同免疫抑制剂联合糖皮质激素治疗特发性膜性肾病的感染风险...

作者：刘德凤重庆医科大学

学位级别：硕士

研究背景特发性膜性肾病(Idiopathic membranous nephropathy,IMN)是成人肾病综合征的常见病因,也是终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD)的主要病因之一。近年来,IMN的发病率有不断上升的趋势,且年轻化。IMN的主要治疗方案是使用... 详细信息

研究背景特发性膜性肾病(Idiopathic membranous nephropathy,IMN)是成人肾病综合征的常见病因,也是终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD)的主要病因之一。近年来,IMN的发病率有不断上升的趋势,且年轻化。IMN的主要治疗方案是使用免疫抑制剂联合糖皮质激素(Glucocorticoids,GC)。然而,不同免疫抑制方案治疗的感染风险尚未有系统比较。因此,我们进行了一项网状meta分析(Network meta-analysis,NMA)来比较不同免疫抑制剂联合GC治疗IMN的感染风险。方法用计算机从PubMed、EMBASE、Cochrane Library、万方、CNKI和维普数据库中搜索所有与IMN治疗相关的随机对照试验(Randomized controlled trials,RCT),并根据以往相关的综述和meta分析中引用的参考文献进一步检索,截至时间为2018年5月21日。采用Rev Man 5.3软件进行传统的meta分析,计算二分类数据的相对危险度(Risk ratio,RR)和95%置信区间(Confidence intervals,CI)的,并采用随机效应模型汇总数据。采用Stata 14.0软件进行NMA,并绘制累积排序概率图下面积(Surface under the cumulative ranking area,SUCRA),对不同干预措施的感染风险进行排序。结果最终纳入了38个RCT包括2066名患者含有9项干预措施。传统meta分析显示他克莫司(Tacrolimus,TAC)联合GC与静脉注射(Intravenous,IV)环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)+GC相比,感染风险显著降低(RR=0.52,95%CI:0.34-0.79)。网状meta分析显示IVCTX+GC与TAC+GC、环孢素A(Cyclosporin,CSA)+GC及口服(Per os,PO)CTX+GC相比,感染风险显著升高(IVCTX+GC ***+GC:RR=1.98,95%CI:1.25-3.13;IVCTX+GC ***+GC:RR=3.35,95%CI:1.31-8.55;POCTX+GC ***+GC:RR=0.39,95%CI:0.20-0.76)。排除随访时间很长(10年)的研究进一步行敏感性分析结果显示非免疫抑制疗法的感染风险与随访时间长短有关,其余结果无明显差异。SUCRA提示CSA+GC感染风险最低(SUCRA86.0%),其次是POCTX+GC(SUCRA 78.6%)。与其他免疫抑制药物相比,IVCTX+GC(SUCRA 16.2%)的感染风险更高。结论与其他免疫抑制剂联合GC相比,CSA+GC和POCTX+GC治疗IMN的感染风险较低。医生应结合免疫抑制剂疗效的数据,为IMN存在感染风险的患者提供个体化的免疫抑制治疗方案。

关键词：特发性膜性肾病环磷酰胺环孢素A 感染网络meta分析

山东地区一株IBDV新型变异株的分离鉴定及致病性研究

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山东地区一株IBDV新型变异株的分离鉴定及致病性研究

作者：刘德凤山东农业大学

学位级别：硕士

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是一种急性、高度传染性的免疫抑制病,给全球家禽养殖业造成了巨大的经济损失。其病原体为传染性法氏囊病病毒(IBDV),主要分为2种血清型,其中只有血清I型对鸡具有致病性。IBDV至今发生... 详细信息

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是一种急性、高度传染性的免疫抑制病,给全球家禽养殖业造成了巨大的经济损失。其病原体为传染性法氏囊病病毒(IBDV),主要分为2种血清型,其中只有血清I型对鸡具有致病性。IBDV至今发生过两次变异,相继出现了经典株(Classical IBDV,c IBDV)、减毒株(Attenuated)、变异株(Variant IBDV,var IBDV)、超强株(Very virulent IBDV,vv IBDV)以及新型变异株(Novel variant IBDV,n Var IBDV)。n Var IBDV几乎不会引起死亡和明显的临床症状,但是会造成严重的免疫抑制,引起其他病原体的继发感染,导致鸡的死亡,造成不可忽视的经济损失。近年来,n Var IBDV在中国广泛流行,给IBD的防控带来了很大挑战。因此分离鉴定养殖场流行的IBDV并对毒株进行遗传进化分析及致病性分析具有十分重要的意义。本研究首先分离鉴定出一株IBDV,将其命名为IBDV-SD-1208,通过遗传进化分析得出该分离株属于n Var IBDV。本研究通过动物回归试验探究该分离株在鸡体内的复制规律,并检测SPF雏鸡感染IBDV-SD-1208后的组织病理学变化及免疫指标的变化。本研究为进一步了解n Var IBDV的致病机理及免疫抑制提供重要研究数据,也为下一步建立有效的防治措施提供理论依据。主要研究内容和结果如下:1、IBDV分离株的遗传进化分析本研究从山东省青州市某禽养殖场中采集到疑似IBDV感染的病料,通过检测确定为IBDV感染,且无其他常见病原感染,在鸡胚中分离纯化得到该毒株。通过与NCBI的IBDV VP2基因进行遗传进化分析,结果发现该分离株与近两年分离到的n Var IBDV SHG352的同源性最高,为97.8%,与其他亚型参考株的同源性低于94%。VP2序列的遗传进化树显示,分离株虽然与美国早期变异株(Variant E)位于同一分支,但与中国发现的n Var IBDV亲缘关系更加接近,表明该分离株属于n Var IBDV。通过比对氨基酸的序列发现,与vv IBDV和c IBDV相比,var IBDV存在13个特征氨基酸位点。而与var IBDV相比,分离株存在4个不同的氨基酸位点,这些突变均发生在抗原位点。除此之外,本研究还发现该分离株具有自身独特的突变位点,该位点位于高变区(HVR)投影域(P)的P结构环中,具有重要研究意义。2、IBDV分离株的致病性研究为了评估该毒株的致病性,通过点眼滴鼻途径用制备的病毒液感染14日龄SPF雏鸡,每只接种0.25 m L(6.940×10copies/m L),对照组中的雏鸡接种相同剂量的无菌磷酸盐缓冲液(PBS),观察并记录感染雏鸡的临床症状,并在1、3、5、7、9、11和14 dpi随机选取3只鸡进行称重并记录体重;剖检取胸腺、脾脏及法氏囊(BF)进行称重及计算免疫器官指数;将免疫器官固定,制备病理切片进行病理组织学观察,同时收取其他组织器官测定病毒载量。研究结果显示,雏鸡在攻毒后未见死亡,且无明显的临床症状,仅有少数有轻微腹泻,泄殖腔羽毛周围沾染粪便;攻毒影响了鸡的生长性能,造成免疫器官损伤;通过计算免疫器官指数,发现病毒造成BF和胸腺的萎缩,脾脏肿大;组织病理学结果也验证了病毒造成免疫器官的不同程度损伤,并使BF内淋巴细胞发生广泛凋亡;通过检测不同组织器官的病毒载量发现,病毒能够在鸡体内迅速复制,在3 dpi便达到峰值,随后稳定在较高的水平。为了评估该毒株诱导的免疫抑制,探究该毒株对NDV疫苗免疫效果的影响。在4 dpi,通过点眼滴鼻途径接种NDV疫苗,收集血清检测NDV抗体水平。结果显示,该分离株抑制了针对NDV抗原的免疫应答,降低了NDV抗体的HI滴度。表明分离株会诱发严重的免疫抑制,从而导致鸡群无法得到疫苗的良好保护。检测促炎性细胞因子m RNA的表达,结果发现促炎性细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的m RNA表达水平在感染急性期均有不同程度的升高,随后逐渐降低。该结果表明IBDV诱导的免疫损伤、炎症及细胞凋亡引起了鸡体内炎性细胞因子失衡。测定外周血淋巴细胞内CD4及CD8的数量及两者比值发现,在感染急性期CD4和CD8 T细胞数量急剧上升,随后降至低于对照组的水平,CD4/CD8的比值始终低于正常范围。表明分离株诱导的免疫损伤引起鸡出现免疫抑制。综上所述,本研究分离得到一株IBDV-SD-1208,遗传进化分析结果显示该毒株属于n Var IBDV。回归动物试验结果显示,鸡在感染病毒后呈现免疫抑制,外周血CD4/CD8比例失调,BF出现严重的病理变化,BF内促炎性细胞因子IL-1β等表达上调,导致组织细胞广泛

关键词：传染性法氏囊病病毒新型变异株萎缩免疫抑制

间充质干细胞外泌体lncRNA ZEB1-AS1通过靶向miR-142-5p/PTEN调控糖尿病性肾病

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中华内分泌代谢杂志 2023年第8期39卷 695-703页

作者：刘德凤胡范玲临沂市中心医院肾内科临沂276400

目的探讨脂肪源间充质干细胞(adMSC)的外泌体长链非编码RNA锌指E盒结合同源框1反义链1(Zinc finger E-box binding homeobox 1 antisense 1,ZEB1-AS1)在糖尿病肾病(DN)中的作用机制。方法采用大鼠DN模型和高糖(HG)诱导的肾小球系膜细胞(... 详细信息

目的探讨脂肪源间充质干细胞(adMSC)的外泌体长链非编码RNA锌指E盒结合同源框1反义链1(Zinc finger E-box binding homeobox 1 antisense 1,ZEB1-AS1)在糖尿病肾病(DN)中的作用机制。方法采用大鼠DN模型和高糖(HG)诱导的肾小球系膜细胞(GMCs)模型进行生化分析和炎症/氧化应激检测;双荧光素酶基因报告实验验证ZEB1-AS1、第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)与microRNA(miR)-142-5p的结合关系;Western blotting检测PTEN蛋白表达水平。结果adMSC分泌的外泌体ZEB1-AS1可降低DN大鼠血糖、血清肌酐、24 h尿蛋白、肾脏重量、肾组织纤维化以及炎症细胞浸润水平。同时,在DN大鼠和HG诱导的GMCs中,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)的表达下降,而谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽(GSH)的表达上升。此外,miR-142-5p能与ZEB1-AS1、PTEN结合;miR-142-5p过表达或PTEN沉默逆转了外泌体ZEB1-AS1对炎症细胞因子水平的抑制作用和对抗氧化酶浓度的促进作用。结论来自adMSC的外泌体ZEB1-AS1通过miR-142-5p/PTEN通路,控制炎症和氧化应激来抑制DN的进展。这表明ZEB1-AS1可能是治疗DN潜在、有效的靶点。

关键词：糖尿病肾病脂肪源间充质干细胞外泌体 lncRNA ZEB1 炎症氧化应激

醛固酮-WNK4途径参与盐负荷对上皮钠通道的调节

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中华肾脏病杂志 2010年第4期26卷 295-299页

作者：刘德凤赖凌云陈靖蔡晖顾勇复旦大学华山医院肾内科复旦大学肾脏病研究所上海200040 Atlanta GA30322USAMedicine and Physiology Renal DivisionEmory University School of Medicine

目的通过建立生理条件下的盐负荷饮食大鼠模型,观察醛同酮和WNK4在水盐代谢调节中的作用.方法将SD大鼠分为5组：高盐组（H,4%NaCl）、正常盐组（N,0.4%NaCl）、低盐组（L,0.07%NaCl）、高盐加醛固酮组（H＋A,4%NaCl＋1 mg·kg^（-1）... 详细信息

目的通过建立生理条件下的盐负荷饮食大鼠模型,观察醛同酮和WNK4在水盐代谢调节中的作用.方法将SD大鼠分为5组：高盐组（H,4%NaCl）、正常盐组（N,0.4%NaCl）、低盐组（L,0.07%NaCl）、高盐加醛固酮组（H＋A,4%NaCl＋1 mg·kg^（-1）·d^（-1）醛固酮）、低盐加螺内酯（L＋S,0.07%NaCl＋0.1 g·kg^（-1）·d^（-1）螺内酯）,所有大鼠自由饮水,喂养2周.用放射免疫法检测血浆醛同酮的变化.应用实时定量PCR和Western印迹法检测大鼠肾脏上皮钠通道γ亚基（γENaC）、WNK4的mRNA和蛋白的变化.结果 H组大鼠血浆醛同酮水平低于N组（P〈0.05）,H＋A组高于H组（P〈0.05）;L组大鼠血浆醛固酮水平高于N组（P〈0.05）,显示SD大鼠造模成功.L组大鼠肾脏γENaC蛋白表达高于N组,但是L＋S低于L组;同时H组低于N组,H＋A组高于H组,差异均有统计学意义（P〈0.05）.mRNA变化趋势和蛋白变化趋势一致.H组肾脏WNK4的蛋白表达高于N组,但是H＋A组低于H组;同时L组低于N组,L＋S组高于L组,差异均有统计学意义（P〈0.05）.mRNA的变化趋势和蛋白的变化趋势一致.结论饮食中的盐可以调节γENaC在肾脏的蛋白表达,醛固酮和WNK4都参与了机体对盐的调节,WNK4受到醛同酮的负调节作用.

关键词：醛固酮氯化钠,膳食螺内酯上皮钠通道 WNK4

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腹痛型急性心肌梗塞34例临床分析

中国实用内科杂志 1991年第2期 110-111页

作者：姜以振,刘德凤山东省济阳县人民医院急诊科 257400 山东省济阳县人民医院内科 257400

本文分析我院1981年2月至1989年12月诊治的以腹痛为特征的急性心肌梗塞34例,以探讨早期诊断线索,减少误诊。发病年龄以55岁以下者居多(31例),男女比例约为1:2。腹痛情况以上腹痛多见(56%)。查体:血压下降者占76%/,第一心音减弱且低钝者... 详细信息

本文分析我院1981年2月至1989年12月诊治的以腹痛为特征的急性心肌梗塞34例,以探讨早期诊断线索,减少误诊。发病年龄以55岁以下者居多(31例),男女比例约为1:2。腹痛情况以上腹痛多见(56%)。查体:血压下降者占76%/,第一心音减弱且低钝者占82%,腹肌紧张者占3%,腹部压痛者占20%,伴恶心呕吐者占53%。心电图示心下壁急性心肌梗塞者91.2%,无心前区疼痛者占94.1%,占同期住院治疗的急性心梗病人的7.1%,误诊时间一般在3～5小时,最长2例达

关键词：急性心肌梗塞下壁急性心梗