醛固酮-WNK4参与盐负荷对远端肾小管钠离子转运体表达的调节

作     者：刘德凤 

作者单位：复旦大学 

学位级别：硕士

导师姓名：顾勇;赖凌云;蔡晖

授予年度：2010年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：盐饮食 醛固酮 钠氯协同转运体 上皮细胞钠通道 WNK4 盐饮食 醛固酮 钠氯协同转运体 上皮钠通道 WNK4 钠氯协同转运体 糖基化 WNK4 

摘      要：第一部分WNK4参与盐负荷对肾脏远端钠离子转运体的调节 背景 高血压及其并发症是威胁人类健康的重要疾病。其中容量代谢在高血压的发病机制中具有重要意义,而肾脏是机体调节水盐代谢的重要器官。肾脏通过肾小球的滤过及肾小管的重吸收来调节机体的容量代谢,存在于肾脏远曲小管的钠氯协同转运子(Na-Cl cotransporter)简称NCC和位于集合管的上皮细胞钠通道(epithelial sodium channel)简称ENaC是肾脏在此段重吸收的主要方式,在生理条件下Na离子在远端肾单位的重吸收仅占滤过液的5%-10%,但是已构成肾钠重吸收的限速部位。由于γ亚基对ENaC的膜定位非常重要,因此yENaC结构和功能的改变可以直接影响血钠的浓度,肾脏远端小管对钠的重吸收依赖于进入远曲小管的氯化钠负荷。长期氯化钠高负荷可引起远端小管细胞超微结构改变,例如DCT细胞肥大,基底膜面积增加,线粒体增大等同时增强远端小管氯化钠共转运蛋白的能力。关于水盐代谢的调节以往了解最多的是醛固酮,早有学者发现醛固酮可以上调NCC及ENaC在肾脏的表达,而近年来人们在研究PHAⅡ(假性低醛固酮血症)的发病过程中发现了一个新的激酶家族With No lysine Kinase简称WNK激酶家族,其中的WNK1和WNK4的基因突变是PHAⅡ的发病原因。研究发现WNK4在体外可以抑制NCC和ENaC在细胞膜的表达,因此本部分研究的主要目的是体内观察WNK4是否参与盐负荷对肾脏远端钠离子转运体表达的调节。 方法 将SD大鼠分为3组：(1)高盐组(H,4%NaCl)(2)正常盐组(N,0.4%NaCl)(3)低盐组(L,0.07%NaCl),所有大鼠自由饮水,喂养2周。动物成模前后检测尾动脉血压,用代谢笼收集24小时尿量检测尿中主要离子的浓度。血生化学检测血肌酐、白蛋白、血电解质等的浓度。用放免方法检测血浆醛固酮的变化。应用Real-timePCR和Western-blot方法检测大鼠肾脏WNK4、NCC、γENaC、和AQP-2的1nRNA和蛋白的变化。 结果 各组大鼠成模后血压、血肌酐、白蛋白、血钠、血钾都在正常范围,与成模前没有明显的变化。高盐组大鼠尿量比成模前有了显著的增多,同时尿中排泄的钠离子有了显著的增多。低盐组大鼠尿中排泄的钠离子有了显著的减少,同时尿中排泄钾离子有了增多。Westernblot和免疫组化显示：AQP-2在高盐组比正常盐组有了增多,在低盐组比正常盐组有了减少。这些都说明盐饮食的动物模型是成功的。符合生理条件下机体对盐的调节。高盐组血浆醛固酮比正常盐组有了显著的减少,低盐组血浆醛固酮比正常盐组有了显著的增多。Real-timePCR和Westernblot显示低盐组大鼠肾脏WNK4的表达比正常盐组有了减少,而高盐组有了增多。低盐组大鼠肾脏NCC和yENaC的表达比正常盐组有了显著的增多,而高盐组有了减少。 结论 控制饮食中的盐可以作为良好的生理条件下的盐饮食模型。饮食中的盐可以调节大鼠肾脏NCC和yENaC的表达。醛固酮和WNK4都参与了这一生理调节过程。 第二部分醛固酮对WNK4的负调节作用 背景 研究发现WNK4在体外可以抑制NCC和ENaC在细胞膜的表达。同时我们的体内研究发现：醛固酮和WNK4都可以影响NCC及ENaC在细胞膜的表达,但是他们之间存在什么联系尚不清楚。有文献提示,WNK4可被(serum-and glucose-regulated kinase)SGK1磷酸化,其作用的发挥有赖于SGK1的活性,而SGKl是一个醛固酮重要的诱导蛋白,参与调节ENaC在细胞膜的表达。因此本部分研究目的在于通过建立生理条件下的盐饮食大鼠模型,同时观察醛固酮和WNK4对NCC及ENaC的影响,探讨生理状态下WNK4与醛固酮之间的可能关系。并进一步探讨他们对NCC的调节机制。 方法 将SD大鼠分为5组：(1)高盐组(H,4%NaCl)(2)正常盐组(N,0.4%NaCl)(3)低盐组(L,0.07%NaCl)(4)高盐加醛固酮组(H+A,4%NaCl+1mg／kg／天醛固酮)(5)低盐加安体舒通(L+S,0.07% NaCl+0.1g／kg／天安体舒通),所有大鼠自由饮水,喂养2周。动物成模前后检测尾动脉血压,用代谢笼收集24小时尿量检测尿中主要离子的浓度。血生化学检测血肌酐、白蛋白、血中主要离子浓度。用放免方法检测血浆醛固酮的变化。应用Real-timePCR和Western-blot方法检测大鼠肾脏NCC,yENaC和WNK4的mRNA和蛋白的变化。用蔗糖密度梯度离心法观察NCC在细胞内的分布变化。 结